FRAP también puede utilizarse para monitorizar proteínas fuera de la membrana. Una vez que la proteína de interés se hace fluorescente, generalmente mediante la expresión de una proteína de fusión GFP, se utiliza un microscopio confocal para fotoblanquear y monitorizar una región del citoplasma, el huso mitótico, el núcleo u otra estructura celular. La fluorescencia media en la región puede entonces representarse en función del tiempo transcurrido desde el fotoblanqueo, y la curva resultante puede arrojar coeficientes cinéticos, como los de las reacciones de unión de la proteína y/o el coeficiente de difusión de la proteína en el medio en el que se está monitorizando. A menudo, las únicas dinámicas consideradas son la difusión y las interacciones de unión/desunión, sin embargo, en principio las proteínas también pueden moverse a través del flujo, es decir, Esto podría deberse al flujo del citoplasma o del nucleoplasma, o al transporte a lo largo de los filamentos de la célula, como los microtúbulos, por parte de motores moleculares.

El análisis es más sencillo cuando la recuperación de la fluorescencia está limitada por la velocidad de difusión en la zona blanqueada o por la velocidad a la que las proteínas blanqueadas se desligan de sus sitios de unión dentro de la zona blanqueada, y son reemplazadas por la proteína fluorescente. Veamos estos dos límites, para el caso común de blanquear una proteína de fusión GFP en una célula viva.

Recuperación de fluorescencia limitada por difusiónEditar

Para un punto de blanqueo circular de radio w {\displaystyle w}

y una recuperación dominada por la difusión, la fluorescencia es descrita por una ecuación derivada por Soumpasis (que implica funciones de Bessel modificadas I 0 {\displaystyle I_{0}}

e I 1 {{displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

con τ D {\displaystyle \tau _{D}}

la escala de tiempo característica para la difusión, y t {\displaystyle t}

es el tiempo. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

es la fluorescencia normalizada (va a 1 cuando t {\displaystyle t}

va al infinito). La escala de tiempo de difusión para un punto blanqueado de radio w {\displaystyle w}

es τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, siendo D el coeficiente de difusión.

Nótese que esto es para un blanqueo instantáneo con un perfil de función escalonada, es decir, la fracción f b {\displaystyle f_{b}}

de proteína que se supone que se blanquea instantáneamente en el momento t = 0 {\displaystyle t=0}

es f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, y f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, para r {\displaystyle r}

es la distancia desde el centro de la zona blanqueada. También se supone que la recuperación puede modelarse mediante difusión en dos dimensiones, que además es uniforme e isótropa. En otras palabras, que la difusión se produce en un medio uniforme, por lo que la constante de difusión efectiva D es la misma en todas partes, y que la difusión es isotrópica, es decir, se produce a la misma velocidad a lo largo de todos los ejes del plano.

En la práctica, en una célula ninguna de estas suposiciones será estrictamente cierta.

1. El blanqueo no será instantáneo. En particular, si se requiere un fuerte blanqueo de un área grande, el blanqueo puede tomar una fracción significativa de la escala de tiempo de difusión τ D {\displaystyle \tau _{D}}
   

   . Entonces una fracción significativa de la proteína blanqueada se difundirá fuera de la región blanqueada realmente durante el blanqueo. No tener en cuenta esto introducirá un error significativo en D.

2. El perfil blanqueado no será una función escalonada radial. Si el punto blanqueado es efectivamente un solo píxel, entonces el blanqueamiento en función de la posición estará típicamente limitado por la difracción y determinado por la óptica del microscopio de escaneo láser confocal utilizado. Esto no es una función de paso radial y también varía a lo largo del eje perpendicular al plano.
3. Las células son, por supuesto, tridimensionales, no bidimensionales, como lo es el volumen blanqueado. Despreciar la difusión fuera del plano (tomamos éste como el plano xy) será una aproximación razonable sólo si la fluorescencia se recupera predominantemente por difusión en este plano. Esto será cierto, por ejemplo, si se blanquea un volumen cilíndrico con el eje del cilindro a lo largo del eje z y con este volumen cilíndrico atravesando toda la altura de la célula. Entonces la difusión a lo largo del eje z no causa la recuperación de la fluorescencia ya que toda la proteína se blanquea uniformemente a lo largo del eje z, y por lo tanto despreciarla, como hace la ecuación de Soumpasis, es inofensiva. Sin embargo, si la difusión a lo largo del eje z contribuye a la recuperación de la fluorescencia, entonces debe tenerse en cuenta.
4. No hay razón para esperar que el citoplasma o el nucleoplasma de la célula sean completamente uniformes o isotrópicos desde el punto de vista espacial.

Por lo tanto, la ecuación de Soumpasis no es más que una aproximación útil, que puede utilizarse cuando las suposiciones enumeradas anteriormente son buenas aproximaciones a la situación real, y cuando la recuperación de la fluorescencia está efectivamente limitada por la escala de tiempo de difusión τ D {\displaystyle \tau _{D}}.

. Nótese que el hecho de que la Soumpasis pueda ajustarse adecuadamente a los datos no implica necesariamente que los supuestos sean ciertos y que la difusión domine la recuperación.

Recuperación limitada por la reacciónEditar

La ecuación que describe la fluorescencia en función del tiempo es particularmente simple en otro límite. Si un gran número de proteínas se unen a sitios en un pequeño volumen tal que allí la señal de fluorescencia está dominada por la señal de las proteínas unidas, y si esta unión es toda en un único estado con una tasa de apagado koff, entonces la fluorescencia en función del tiempo viene dada por

f ( t ) = 1 – e – k off t {displaystyle f(t)=1-e^{-k_{text{off}}t}.

Nótese que la recuperación depende únicamente de la constante de velocidad de desenganche, koff. No depende de la tasa de unión. Aunque sí depende de una serie de suposiciones

1. La tasa de on debe ser lo suficientemente grande para que la concentración local de proteína unida supere en gran medida la concentración local de proteína libre, y así permitirnos despreciar la contribución a f de la proteína libre.
2. La reacción es una reacción bimolecular simple, en la que la proteína se une a sitios localizados que no se mueven significativamente durante la recuperación
3. El intercambio es mucho más lento que la difusión (o cualquier mecanismo de transporte responsable de la movilidad), ya que sólo entonces la fracción difusora se recupera rápidamente y entonces actúa como fuente de proteína fluorescente que se une y sustituye a la proteína blanqueada unida y así aumenta la fluorescencia. Con r el radio de la mancha blanqueada, esto significa que la ecuación sólo es válida si el tiempo de vida ligado 1 / k off >> r 2 / D {{displaystyle 1/k_{text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Si se cumplen todos estos supuestos, el ajuste de una exponencial a la curva de recuperación dará la constante de velocidad de apagado, koff. Sin embargo, otras dinámicas pueden dar curvas de recuperación similares a las exponenciales, por lo que ajustar una exponencial no implica necesariamente que la recuperación esté dominada por una simple reacción bimolecular. Una forma de distinguir entre la recuperación con una tasa determinada por la desvinculación y la recuperación limitada por la difusión, es observar que la tasa de recuperación para la recuperación limitada por la desvinculación es independiente del tamaño del área blanqueada r, mientras que escala como r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, para la recuperación limitada por difusión. Así, si se blanquea un área pequeña y una grande, si la recuperación está limitada por la desvinculación entonces las tasas de recuperación serán las mismas para los dos tamaños de área blanqueada, mientras que si la recuperación está limitada por la difusión entonces será mucho más lenta para el área blanqueada más grande.

Difusión y reacciónEditar

En general, la recuperación de la fluorescencia no estará dominada ni por la difusión isotrópica simple, ni por una única tasa de desligamiento simple. Habrá tanto difusión como unión, y de hecho la constante de difusión puede no ser uniforme en el espacio, y puede haber más de un tipo de sitios de unión, y estos sitios también pueden tener una distribución no uniforme en el espacio. Los procesos de flujo también pueden ser importantes. Este comportamiento más complejo implica que se requiere un modelo con varios parámetros para describir los datos; los modelos con una sola constante de difusión D o una sola constante de velocidad de apagado, koff, son inadecuados.

Hay modelos con difusión y reacción. Desgraciadamente, una sola curva FRAP puede proporcionar pruebas insuficientes para ajustar de forma fiable y única los datos experimentales (posiblemente ruidosos). Sadegh Zadeh et al. han demostrado que las curvas FRAP pueden ser ajustadas por diferentes pares de valores de la constante de difusión y la constante de reacción, o, en otras palabras, que los ajustes a la FRAP no son únicos. Esto es en los ajustes de tres parámetros (constante de on-rate, constante de off-rate y constante de difusión). Los ajustes que no son únicos, generalmente no son útiles.

Por lo tanto, para los modelos con un número de parámetros, un solo experimento FRAP puede ser insuficiente para estimar todos los parámetros del modelo. Entonces se requieren más datos, por ejemplo, blanqueando áreas de diferentes tamaños, determinando algunos parámetros del modelo independientemente, etc.