Tipos de hemocitos en grillos

La figura 1A muestra una imagen de microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de hemocitos de grillo, que muestra células de varios tamaños y formas. Para la identificación precisa de estos hemocitos, se clasificaron aproximadamente 1.000 células por su tamaño y morfología (datos no mostrados) en seis tipos (Fig. 1B~G). Como se muestra en la Fig. 1B, se observó el típico granulocito en la hemolinfa. Los granulocitos eran generalmente de forma redonda u ovalada, y se observaron muchos gránulos polimórficos dentro del citoplasma. En la membrana plasmática de los granulocitos se observaron pequeños pseudopodios o filopodios (Fig. 1B, indicados con flechas blancas). La célula mostrada en la Fig. 1C fue considerada como plasmatocitos debido a su típica forma de huso y a las largas estructuras en forma de pelo observadas en ambos extremos de la membrana plasmática (indicadas por flechas blancas). La Figura 1D muestra un prohemocito, que son las células redondas más pequeñas observadas en la hemolinfa de los insectos. Los núcleos eran grandes en relación con el tamaño de la célula y estaban situados en el centro de la misma (Fig. 1D). Así, el citoplasma y el núcleo de los prohemocitos eran a menudo indistinguibles. La figura 1E muestra un coagulocito que contiene varios gránulos citoplasmáticos. Las membranas plasmáticas de los coagulocitos eran lisas, sin ninguna estructura, y sus núcleos eran grandes y fácilmente observables. Los enocitoides eran el tipo de hemocito más grande observado y eran escasos en la hemolinfa (Fig. 1F). Los enocitoides solían tener una forma de huevo frito redondo con numerosos gránulos citoplasmáticos. La figura 1G muestra un esferulocito, que era redondo y de tamaño medio con muchos gránulos pequeños oscuros o brillantes en el citoplasma. Como se muestra en la Fig. 1D~G, no eran visibles estructuras en las membranas plasmáticas de los prohemocitos, coagulocitos, oenocitos o esferulocitos, que eran ópticamente muy lisos.

Los seis tipos de hemocitos observados en la sangre de los grillos. Forma general y tamaño relativo de los hemocitos en la hemolinfa (A). Los seis tipos de hemocitos encontrados en G. bimaculatus se clasificaron como granulocitos (B ; GR), plasmatocitos (C ; PL), prohemocitos (D ; PR), coagulocitos (E ; CO), enenocitoides (F ; OE) y esferulocitos (G ; AD) en función de su tamaño y morfología. Las estructuras en forma de abanico o ameba en la membrana plasmática de los granulocitos y plasmocitos se indican con flechas blancas (B y C). Barra de escala = 25 µm (A) o 10 µm (B~G).

Nodulación y encapsulación por parte de los hemocitos

En los insectos, las respuestas inmunitarias celulares, como la nodulación, la encapsulación y la fagocitosis, son llevadas a cabo por hemocitos inmunitarios como los granulocitos y los plasmocitos. Tras la exposición al patógeno, estos hemocitos cambian su forma y desarrollan grandes estructuras en forma de ameba o abanico en sus membranas plasmáticas. Para observar estos rápidos cambios morfológicos en tiempo real, desarrollamos una técnica que nos permite cultivar hemocitos de insectos durante 7 días conservando la actividad fisiológica (descrita en los Materiales y Métodos). Aunque no pudimos establecer líneas de hemocitos estables que puedan pasarse durante varios años, pudimos observar la morfología de los hemocitos en respuesta a los patógenos in vitro. La Película Suplementaria C muestra sólo los hemocitos después de 12 h de incubación. La mayoría de las células cultivadas se movían activamente. Algunas células mostraban redes alrededor de la membrana celular durante el cultivo y se encontraban adheridas a los portaobjetos de cultivo. Los hemocitos rara vez se agregaron o formaron grandes grupos.

La figura 2A muestra hemocitos cultivados con E. coli (véase también la película suplementaria 1). Se observó que algunos hemocitos estaban más agregados y se movían. A medida que aumentaba el tiempo de incubación, los hemocitos específicos producían redes (pelos parecidos a las amebas o trampas extracelulares), y varios hemocitos se reunían mediante estas redes para formar grandes grupos (Fig. 2A-1~A-6; los pelos parecidos a las amebas o las trampas extracelulares se indican con flechas negras). Como se muestra en la Fig. 2A-1, tres grupos de hemocitos (indicados por círculos negros) fueron finalmente reunidos en un grupo por las redes (Fig. 2A-5 y A-6).

Imágenes de células vivas de hemocitos de grillo infectados con E. coli o perlas de Sephadex. (A) Imágenes de microscopio de luz que muestran hemocitos cultivados con E. coli. A medida que aumentaba el tiempo de incubación, los hemocitos específicos producían redes (pelos parecidos a las amebas o trampas extracelulares; indicado por las flechas negras). Los seis tipos de hemocitos se agregaron en grandes grupos gracias a estas redes (A-1~A-6; indicadas por recuadros negros). Película disponible como Película 1 (tiempo en minutos post-inoculación). (B) Imágenes de microscopio de luz que muestran los hemocitos cultivados con perlas de Sephadex. Las perlas de Sephadex alrededor de los hemocitos estaban etiquetadas aleatoriamente como SP1, SP2, SP3, SP4 y SP5. Con el tiempo, las perlas de Sephadex (SP1, SP2, SP3 y SP4) fueron rodeadas por los hemocitos y encapsuladas por varios tipos de redes (B-1~B-9; indicadas por flechas negras). Película disponible como Película 2 (tiempo en minutos tras la inoculación). Barra de escala = 25 µm (A y B). La película C muestra hemocitos cultivados solos, sin perlas Sephadex. La mayoría de los hemocitos se movían activamente. Unas pocas células estaban adheridas a los portaobjetos de cultivo mediante redes de membrana plasmática. Sin embargo, no se observaron grandes agrupaciones de hemocitos.

Sin embargo, no fue posible determinar si la reunión de los hemocitos descrita anteriormente fue provocada por E. coli. Para abordar esta cuestión, se activaron los hemocitos con perlas de Sephadex (120 μm de diámetro), que pueden observarse fácilmente con un microscopio DIC (Fig. 2B, Película suplementaria 2). Como se muestra en la Fig. 2A, las perlas de Sephadex fueron capturadas por las redes generadas por hemocitos específicos (Fig. 2B; redes indicadas por flechas negras en los recuadros amarillos). Las perlas de Sephadex alrededor de los hemocitos fueron etiquetadas aleatoriamente como SP1, SP2, SP3, SP4 y SP5. Como puede verse comparando las Fig. 2B-2 y B-3, SP1, SP2 y SP3 se juntaron y entraron en la zona indicada por el recuadro amarillo. Además, SP1 llegó a estar completamente rodeado por varios hemocitos (Fig. 2B-9). La perla etiquetada como SP4 también se incorporó al grupo con SP1, SP2 y SP3 (Fig. 2B-4~B-9; indicado por el recuadro amarillo). Con el tiempo, todas las perlas de Sephadex (SP1, SP2, SP3 y SP4) se rodearon de muchos hemocitos. Por el contrario, se observó que algunos hemocitos estaban en contacto con SP5, pero éste no llegó a ser arrastrado a la zona indicada por el recuadro amarillo, aunque se encontraba en una posición similar a la de SP1. Por lo tanto, la nodulación por parte de los hemocitos parecía producirse de forma aleatoria.

Activación de granulocitos por perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato

A continuación, investigamos qué hemocitos producían las redes y participaban en los distintos pasos de la respuesta inmunitaria, incluyendo la encapsulación y la nodulación. Para ello, se utilizaron perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato, que pueden observarse fácilmente con un microscopio DIC, en lugar de patógenos, y se recogieron imágenes en tiempo real de los hemocitos. La Figura 3A muestra los hemocitos estimulados con perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato durante 12 h (Película suplementaria 3). Las redes producidas por los hemocitos (indicadas por flechas negras) se movieron activamente alrededor de las perlas de látex (indicadas por flechas rojas) (Fig. 3A-1). Con el tiempo, las cuentas fueron engullidas por las redes y finalmente pudieron verse dentro del citoplasma de los hemocitos (Fig. 3A-2~A-4). Sin embargo, no todas las perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato que encontraron una red fueron fagocitadas. Por lo tanto, el movimiento de los hemocitos activados no parecía corresponder precisamente con el movimiento de las perlas.

Imágenes de células vivas de granulocitos estimulados con perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato. (A) Imágenes de microscopio de luz que muestran hemocitos cultivados con perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato durante 12 h. A-1~A-4, hemocitos cultivados después de 12~18 min. Las redes producidas por los hemocitos (flechas negras) pueden verse formando alrededor de las perlas de látex (indicadas con flechas rojas). Las perlas de látex fueron engullidas por las redes y finalmente fueron capturadas dentro del citoplasma de los hemocitos (A-4). Película disponible como Película 3 (tiempo en minutos después de la estimulación). Barra de escala = 40 µm. (B) Imágenes ampliadas. (B-1) Después de 4 h, muchas perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato fueron capturadas por los hemocitos (perlas de látex, flechas rojas; y hemocitos específicos, círculos blancos). (B-2~B-6) Granulocitos cultivados a las 0, 2, 4, 12 y 48 h después de la estimulación. (B-2) Granulocitos en reposo, de forma redonda u ovalada. (B-3) A las 2 h después de la estimulación, los granulocitos empezaron a mostrar cambios morfológicos, y se pueden ver estructuras de la membrana plasmática en forma de abanico o ameba (flechas blancas). (B-4 y -5) Un gran número de perlas de látex se había acumulado en el citoplasma de los granulocitos a las 4 y 12 h post-infección. (B-6) A las 48 h post-infección, se habían acumulado muchas perlas de látex en el citoplasma de los granulocitos, pero ya no se observaban redes, y muchos granulocitos parecían estar inertes. Barra de escala = 15 µm (B-1) o 10 µm (B-2~B-6).

Se realizaron observaciones detalladas utilizando un microscopio confocal de gran aumento (Fig. 3B). A las 4 horas después de la infección, las perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato podían observarse dentro de ciertos hemocitos (Fig. 3B-1; las perlas se indican con flechas rojas, y los hemocitos específicos se indican con círculos blancos). A continuación observamos qué células específicas engullían las perlas de látex con más detalle (Fig. 3B-2~B-6). La figura 3B-2 muestra los granulocitos en reposo, que por lo general eran de forma redonda u ovalada, con muchos gránulos oscuros polimórficos dentro del citoplasma. A las 2 horas de la estimulación con perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato, los granulocitos empezaron a mostrar cambios morfológicos, incluyendo protuberancias de la membrana plasmática en forma de abanico o ameba (Fig. 3B-3; indicado con flechas blancas). Se observaron perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato dentro del citoplasma de los granulocitos a las 4 h después de la estimulación, y un gran número de perlas de látex se habían acumulado en el citoplasma de muchos granulocitos a las 12 h después de la estimulación (Fig. 3B-4 y B-5; las perlas se indican con flechas rojas y las redes con flechas blancas). Además, se observó que las redes se hacían más grandes y anchas con el tiempo (Fig. 3B-4 y B-5). A las 48 h después de la estimulación, muchas perlas de látex se habían acumulado en el citoplasma de los granulocitos, pero las redes ya no podían verse, y muchos granulocitos parecían estar inertes (Fig. 3B-6; perlas indicadas con flechas rojas).

Como se muestra en la Fig. 2, los granulocitos parecían adherirse no sólo a otros granulocitos, sino también a diferentes tipos de hemocitos utilizando estas redes. No observamos fagocitosis en ningún otro tipo celular, excepto en un pequeño número de plasmatocitos (datos no mostrados). Además, no observamos ninguna actividad inmunológica ni cambios morfológicos en ningún tipo de célula aparte de los granulocitos y un pequeño número de plasmatocitos.

Los lisosomas de los granulocitos se activaron mediante la inyección de partículas de E. coli

Para investigar si las vacuolas observadas dentro de los granulocitos eran fagosomas relacionados con patógenos, se inyectaron a los grillos partículas de E. coli, que se utilizan principalmente como marcadores de fagocitosis y que presentan fluorescencia verde cuando alcanzan orgánulos acidificados como los lisosomas intracelulares. Al mismo tiempo, los hemocitos totales se tiñeron con LysoTracker Red, que etiqueta los lisosomas. Como se muestra en la Fig. 4A-1, se observó una señal fluorescente verde (partículas de E. coli fagocitadas) en el citoplasma de los granulocitos inmediatamente después de la inyección de las partículas. Al mismo tiempo, también se observó una señal fluorescente roja, que indica la formación de lisosomas activados (Fig. 4A-2). A las 4 h después de la inyección, se pudieron observar vacuolas altamente polimorfas en muchos granulocitos (Fig. 4A-4 y A-5). Se muestran imágenes fusionadas de la señal verde fluorescente (partículas de E. coli fagocitadas) y la señal roja fluorescente (lisosomas activados) (Fig. 4A-6). A las 12 horas después de la inyección, la señal fluorescente verde comenzó a atenuarse, mientras que la señal fluorescente roja se mantuvo (Fig. 4A-7~A-9). A las 24 horas de la inyección, ambas señales fluorescentes se habían atenuado (Fig. 4A-10~A-12). Sin embargo, la señal fluorescente roja en los granulocitos se observó de nuevo a las 48 h después de la inyección (Fig. 4A-13~A-15). La figura 4Aa~Ao muestra los recuadros de los paneles A-1~A-15 (indicados con recuadros blancos) a mayor aumento. Los grillos que fueron inyectados con tampón PBS sólo fueron negativos para la fluorescencia roja y verde en todos los puntos de tiempo después de la inyección (Fig. 4B).

Etiquetado de lisosomas de granulocitos en grillos inyectados con partículas de E. coli fluorescentes verdes. (A) Desarrollo de los lisosomas de los granulocitos a las 0 h, 4 h, 12 h, 24 h y 48 h después de la inyección de partículas de E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10 y A-13) Las partículas de E. coli, que se utilizan como marcadores de fagocitosis, presentan fluorescencia verde cuando alcanzan orgánulos acidificados como los lisosomas intracelulares. (A-2, A-5, A-8, A-11 y A-14) Imágenes de microscopio fluorescente confocal de granulocitos teñidos con LysoTracker Red (un marcador lisosomal). (A-1 y A-2) Las señales fluorescentes verdes y rojas podían observarse en el citoplasma de los granulocitos a partir de 1 h después de la inyección. (A-4 y A-5) Muchos granulocitos mostraron fluorescencia verde y roja en las vacuolas altamente polimórficas de los granulocitos a las 4 h post-inyección. (A-7 y -8) A las 12 h post-inyección, la señal fluorescente verde se había atenuado pero la señal fluorescente roja permanecía. (A-10 y A-11) A las 24 horas después de la inyección, las señales fluorescentes verde y roja casi habían desaparecido. (A-13 y A-14) A las 48 h después de la inyección, la señal fluorescente verde había desaparecido por completo, pero se observaba de nuevo la señal fluorescente roja. Se muestran imágenes fusionadas de las señales fluorescentes verdes y rojas (A-3, A-6, A-9, A-12 y A-15). (a~o) Los recuadros de los paneles A-1 ~A-15 (indicados con recuadros blancos) a mayor aumento. (B) La señal roja fluorescente en los granulocitos de grillos que fueron inyectados con PBS (control negativo). (C) Análisis de citometría de flujo a 1 h~48 h después de la inyección. (C-1 y C-2) La señal verde fluorescente fue del 2,08% a 1 h después de la inyección y aumentó al 24,6% a 4 h después de la inyección. (C-3~C-5) La señal verde fluorescente disminuyó gradualmente, hasta el 10,87% a las 12 h, el 3,98% a las 24 h y el 1,74% a las 48 h. (C-1-1~C-4-1) La señal roja fluorescente aumentó hasta el 69,54% a las 12 h después de la inyección y disminuyó hasta el 5,78% a las 24 h después de la infección. (C-5-1) La señal roja fluorescente aumentó de nuevo, hasta el 30,25%, a las 48 h después de la inyección. (C-1-2~C-5-2) La señal fluorescente roja en los granulocitos de los grillos a los que se les inyectó sólo tampón PBS. (D) Los análisis de citometría de flujo se repitieron tres veces.

Para cuantificar las señales de fluorescencia verde y roja en grillos inyectados con PBS o E. coli, se analizaron los hemocitos por citometría de flujo a las 0~48 h después de la inyección (Fig. 4C). A las 0 horas después de la inyección, el 2,08% de los hemocitos eran positivos para la fluorescencia verde, y esto aumentó al 24,36% a las 4 horas después de la inyección (Fig. 4C-1 y C-2). La señal verde fluorescente disminuyó gradualmente hasta el 10,87% de los hemocitos a las 12 h, el 3,98% a las 24 h y el 1,74% a las 48 h (Fig. 4C-3~C-5). Estos resultados indican que las partículas de E. coli fueron activamente engullidas y digeridas por los granulocitos y fueron completamente eliminadas a las 48 horas después de la inyección. A las 12 horas después de la inyección, el 69,54% eran positivas para la fluorescencia roja, y la señal disminuyó al 5,78% de los hemocitos a las 24 horas después de la inyección (Fig. 4C-1-1~C-4-1). En consonancia con nuestras observaciones microscópicas, la señal de fluorescencia roja aumentó hasta el 30,25% de los hemocitos a las 48 h después de la inyección. Por el contrario, los grillos que fueron inyectados con PBS fueron negativos para la fluorescencia verde y roja en todos los puntos de tiempo (Fig. 4C-1-2~C-5-2). El análisis de citometría de flujo se repitió tres veces (Fig. 4D).

Reactivación de los lisosomas de los granulocitos a las 48 h después de la infección

La reactivación de los lisosomas de los granulocitos a las 48 h después de la infección se investigó más a fondo mediante observación microscópica (Fig. 5A y B). Como se muestra en la Fig. 4A, la señal fluorescente verde (partículas de E. coli fagocitadas) y la señal fluorescente roja (lisosomas activados) se observaron a las 4 h después de la inyección (Fig. 5A-1~A-3). Las señales fluorescentes se habían atenuado a las 24 h después de la infección (Fig. 5A-4~A-6). A las 24 h post-infección, observamos que se podían ver células dentro del citoplasma de los granulocitos (Fig. 5A-4~A-6; indicado con flechas blancas). Este fenómeno fue más evidente a las 48 h post-infección (Fig. 5A-7~A-9; indicado con flechas blancas). Además, los lisosomas alrededor de estas células engullidas a las 48 h post-infección estaban activados (Fig. 5A-8). Como se muestra en las Fig. 4A-14, 4C-5-1, estas observaciones microscópicas parecen explicar el aumento de la señal fluorescente roja a las 48 h post-infección. Para confirmarlo, se tiñeron los núcleos de los granulocitos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a las 48 h post-infección. Como se muestra en la Fig. 5B-1, se observaron frecuentemente granulocitos con dos núcleos. Ocasionalmente, también se observaron granulocitos que contenían más de dos núcleos, o núcleos deformados (Fig. 5B-2 y B-3; indicados por flechas blancas).

Reactivación de los lisosomas de los granulocitos a las 48 h post-infección. (A) Imágenes de microscopio fluorescente de granulocitos a las 4 h, 24 h y 48 h después de la inyección. (A-1 y A-2) Los granulocitos mostraron señales fluorescentes verdes y rojas en las vacuolas altamente polimorfas a las 4 h post-inyección. (A-4 y A-5) A las 12 h después de la inyección, la señal fluorescente verde se había atenuado, pero la señal fluorescente roja permanecía. Además, se observaron algunas células dentro del citoplasma de los granulocitos (flechas blancas). (A-7 y A-8) Este fenómeno se observó con mayor frecuencia a las 48 h después de la inyección. Además, los lisosomas que rodeaban a estas células engullidas estaban activados (A-8). Se muestran imágenes fusionadas de las señales fluorescentes verdes y rojas (A-3, A-6 y A-9). (B) Granulocitos teñidos con DAPI a las 48 h después de la inyección. (B-1) Se observan dos núcleos en el citoplasma de los granulocitos. (B-2 y B-3) Ocasionalmente, se observaron dos o más núcleos, o núcleos deformados, en el citoplasma de los granulocitos (indicados con flechas blancas). Barra de escala = 10 µm (A) o 20 µm (B).

Muerte celular de los granulocitos relacionada con la necrosis a las 48 h post-infección

Como se muestra en las Figs. 3B-6 y 5A-8, la acumulación de fagosomas en los granulocitos alteró su forma e indujo la muerte celular. A las 48 h después de la infección, los hemocitos se tiñeron con anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y yoduro de propidio (PI) para confirmar la muerte celular apoptótica o necrótica (Fig. 6A). La señal verde fluorescente (anexina V) sólo aumentó ligeramente entre las 12 h y las 48 h (Fig. A-10, A-7 y A-10), pero la señal roja fluorescente (PI) mostró una fuerte tinción a las 12 h post-infección (Fig. 6A-5). A las 24 y 48 h post-infección, la señal roja fluorescente persistió (Fig. 6A-8 y A-11). Se muestran imágenes fusionadas de la señal roja fluorescente (PI) y las imágenes DIC (Fig. 6A-3, A-6, A-9 y A-12). La figura 6Aa~Ad muestra los recuadros de los paneles A-3, A-6, A-9 y A-12 indicados por los recuadros a mayor aumento. Estos resultados indican que la acumulación de fagosomas en los granulocitos no indujo una muerte celular apoptótica típica, sino una muerte celular relacionada con la necrosis. Para cuantificar la tinción con PI, se tiñeron los hemocitos y se examinaron por citometría de flujo a las 0 h, 12 h, 24 h y 48 h después de la infección. A las 12 h después de la infección, el 71,29% de los granulocitos se tiñeron con PI, en comparación con el 13,52% a las 0 h (Fig. 6B-1 y B-2). A las 24 horas después de la infección, la tinción con PI había disminuido ligeramente, hasta el 45,97%, pero volvió a aumentar hasta el 76,24% a las 48 horas (Fig. 6B-3 y B-4). El análisis de citometría de flujo se repitió tres veces (Fig. 6C).