TEXT
Yersinia pestis è l’agente eziologico della peste e ha il potenziale per essere usato come arma biologica (1, 13, 17-20, 23). A causa di questo, è importante che la resistenza emergente ai farmaci, sia naturale che ingegnerizzata, sia rilevabile utilizzando metodi standardizzati che sono facilmente implementati in più laboratori. Il Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) descrive un metodo di riferimento di microdiluizione in brodo (BMD) per il test di suscettibilità antimicrobica di Y. pestis e fornisce linee guida interpretative della MIC per otto agenti antimicrobici (6). Il BMD utilizza il brodo di Mueller-Hinton corretto per i cationi (CAMHB) e richiede l’incubazione a 35°C per 24 ore con un’opzione per l’incubazione per 48 ore quando la crescita a 24 ore è insufficiente per l’interpretazione del punto finale. Purtroppo, il BMD di riferimento è difficile da incorporare in molti laboratori perché è relativamente costoso e laborioso e richiede la conservazione dei pannelli in un formato congelato o disidratato. Esistono diversi metodi alternativi di test di suscettibilità, compresi i metodi di diffusione su disco e Etest. Tuttavia, prima che questi metodi possano essere impiegati per una specie, devono essere valutati e confrontati con il BMD per determinare le correlazioni tra i risultati ottenuti dal confronto dei metodi.
Gli isolati di Y. pestis sono fastidiosi e possono crescere più lentamente su terreni artificiali rispetto ad altre specie comuni di Enterobacteriaceae, e quindi i metodi di test di suscettibilità per Y. pestis sono stati difficili da standardizzare. In letteratura sono descritti diversi metodi. Il test di diffusione su disco è stato generalmente eseguito su agar Mueller-Hinton (MHA), in genere utilizzando 48 ore di incubazione a 35°C, ma le descrizioni metodologiche sono talvolta carenti di dettagli (10, 16, 24). Il metodo Etest è stato impiegato da Wong et al. (25) utilizzando MHA con 5% di sangue di pecora, incubazione a 35°C, e un inoculo corrispondente a no. 1 McFarland invece dello standard 0,5 McFarland usato nella maggior parte degli studi di diffusione su disco o Etest. La diluizione in agar, utilizzando MHA incubato a 27°-30°C per 48 ore, è il metodo più comune riportato in letteratura (7, 8, 11, 12, 22). Anche i metodi di macrodiluizione in brodo e di microdiluizione sono stati utilizzati con varie temperature di incubazione (2, 21).
Ci sono diversi attributi dei metodi di diffusione su disco e di Etest che li rendono attraenti metodi alternativi per i test di suscettibilità, compresa la facilità di conservazione e una lunga durata dei dischi e delle strisce. Inoltre, questi sono metodi basati su agar e gli endpoint possono essere più facili da leggere rispetto a quelli del BMD. L’Etest ha l’ulteriore vantaggio di produrre un risultato MIC. In questa relazione, presentiamo i risultati di uno studio multicentrico che confronta l’Etest e i metodi di diffusione su disco con il metodo di riferimento BMD del CLSI per il test di suscettibilità di Y. pestis.
(Questa relazione è stata presentata in parte al 107° General Meeting dell’American Society for Microbiology, Toronto, Canada, 21-25 maggio 2007.)
Ventisei ceppi diversi di Y. pestis provenienti dalle collezioni dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) e dello U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) sono stati testati sia con i metodi Etest che BMD in quattro siti di test e in aggiunta con la diffusione su disco in due di questi siti. Sei ceppi erano biovar Antiqua, sette erano biovar Medievalis e 12 erano biovar Orientalis; un isolato atipico non poteva essere assegnato a nessuna biovar. Gli agenti antimicrobici sono stati testati sia da BMD che da Etest (bioMérieux, Durham, NC), e le loro gamme corrispondenti erano le seguenti per BMD ed Etest, rispettivamente: per il cloramfenicolo, da 0,03 a 64 μg/ml e da 0,016 a 256 μg/ml; per la ciprofloxacina, da 0,03 a 64 μg/ml e da 0,002 a 32 μg/ml; per la doxiciclina, da 0,03 a 64 μg/ml e da 0.016 a 256 μg/ml; per la gentamicina, 0,03 a 64 μg/ml e 0,016 a 256 μg/ml; per la levofloxacina, 0,06 a 64 μg/ml e 0,002 a 32 μg/ml; per la streptomicina, 0,03 a 64 μg/ml e 0.016 a 256 μg/ml; per la tetraciclina, 0.03 a 64 μg/ml e 0.016 a 256 μg/ml; e per il trimetoprim-sulfametossazolo, 0.015/32 a 16/304 μg/ml e 0.002/0.038 a 32/608 μg/ml. Poiché le gamme per il test BMD di alcuni farmaci non comprendeva le concentrazioni inferiori ottenibili dall’Etest, l’accordo essenziale (± 1 diluizione log2) tra i metodi è stato considerato fuori scala per alcuni confronti di risultati (ad esempio, un BMD levofloxacina MIC di ≤ 0.06 μg/ml e un Etest MIC di 0.03 μg/ml). Al CDC, i vassoi MIC a 96 pozzetti sono stati preparati utilizzando 100 μl di CAMHB (BBL, Sparks, MD) per pozzetto; i vassoi sono stati tenuti congelati a -70°C e spediti ai laboratori partecipanti. I test sono stati eseguiti con i metodi standard CLSI per BMD e diffusione su disco (4-6). Gli inoculi sono stati preparati da colture aerobiche di 18-24 ore coltivate su piastre di agar sangue di pecora al 5% (BBL) con il metodo della sospensione diretta delle colonie in brodo Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) per ottenere uno standard di torbidità di 0,5 McFarland (4); gli stessi inoculi sono stati utilizzati per inoculare piastre MHA di 150 mm di diametro per i test Etest e diffusione a disco. Immediatamente dopo l’inoculazione, almeno due conteggi casuali delle colonie sono stati eseguiti in ogni sito di test con il pozzo di controllo della crescita BMD positivo, al fine di valutare le dimensioni dell’inoculo. Non sono state applicate più di quattro strisce Etest su una piastra. Per la diffusione su disco, sono stati applicati dischi commerciali (BBL) con un dispenser multidisco auto-tampante (BBL). I pannelli BMD e le piastre MHA sia per l’Etest che per la diffusione su disco sono stati incubati a 35°C e letti in periodi di 24 e 48 ore. Gli Etest sono stati letti come indicato secondo i foglietti illustrativi Etest come segue: cloramfenicolo, doxiciclina, tetraciclina e trimetoprim-sulfametossazolo sono stati letti all’80% di inibizione per il punto di intersezione; ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina e streptomicina sono stati letti al 100% di inibizione. Per le analisi dei dati, le MIC dell’Etest sono state arrotondate alla diluizione log2 più vicina. Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 sono stati utilizzati per il controllo di qualità BMD ed Etest. Le MIC per i ceppi di controllo di qualità sono state determinate dall’incubazione per 16-20 ore. Le gamme di controllo di qualità BMD accettabili per la streptomicina sono state precedentemente stabilite al CDC (dati non pubblicati). Il controllo di qualità del cloramfenicolo Etest è stato eseguito testando Escherichia coli ATCC 25922 e applicando l’intervallo accettabile per il CLSI BMD.
Per misurare l’accordo tra i risultati Etest e BMD, è stata esaminata la distribuzione delle differenze nelle MIC di diluizione log2 e la percentuale di determinazioni MIC che hanno dato valori identici (accordo essenziale entro i limiti di precisione del metodo di riferimento) è stata calcolata per ogni farmaco. Inoltre, per determinare se il metodo Etest ha prodotto MIC significativamente inferiori o superiori al metodo di riferimento, abbiamo eseguito un test Wilcoxon signed-rank con le MIC in diluizione log2 dei due test utilizzando il software statistico SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); le MIC entro ± 1 diluizione log2 sono state considerate identiche per questo test. Il confronto dei risultati delle categorie interpretative (suscettibile, intermedio e resistente) è stato fatto calcolando i tassi di errori minori, maggiori e molto maggiori.
In generale, i punti finali MIC erano più facilmente distinguibili da BMD che da Etest a 24 ore (dati non mostrati). In tre siti di test (A, B e C), quasi tutti i BMD e Etest MIC erano leggibili a 24 ore di incubazione; un singolo risultato Etest era l’eccezione. Il sito D ha riportato MIC BMD leggibili a 24 ore per tutti i ceppi tranne uno. La crescita era insufficiente per leggere le MIC dell’Etest a 24 ore per otto ceppi nel sito D. Il numero di MIC Etest che non erano leggibili a causa di una crescita inadeguata a 24 ore per farmaco era il seguente: per cloramfenicolo, n = 6; per ciprofloxacina, n = 4; per doxiciclina, n = 3; per gentamicina, n = 2; per levofloxacina, n = 5; per streptomicina, n = 5; per tetraciclina, n = 4; e per trimetoprim-sulfametossazolo, n = 4. Tutti i siti di test sono stati in grado di leggere tutti i risultati a 48 ore. Pertanto, i risultati a 48 ore sono stati utilizzati nel confronto. La conta delle colonie ha dimostrato che le densità di inoculo nei pozzetti BMD erano entro limiti accettabili per tutti e quattro i siti di test; le medie per i siti variavano da 1,1 × 105 CFU/ml a 4,2 × 105 CFU/ml.
La MIC90 e l’intervallo MIC per ogni agente antimicrobico sono stati confrontati per metodo (Tabella 1). Per tutti i farmaci tranne il cloramfenicolo, le MIC90 per tutti i metodi erano uguali o entro ± 1 diluizione log2 l’una dall’altra. L’accordo di categoria tra i metodi Etest e BMD per tutti i farmaci era eccellente dal 97% al 100%; tutti gli errori erano minori (Tabella 1). Tutte le MIC del BMD e dell’Etest erano all’interno dell’intervallo suscettibile dopo 24 ore di incubazione (dati non mostrati). A 48 ore, la maggior parte delle MIC erano all’interno dell’intervallo di suscettibilità tranne i seguenti risultati non suscettibili: cloramfenicolo (n = 2); ciprofloxacina (n = 1); e streptomicina (n = 5). La maggior parte dei risultati non suscettibili provenivano dal metodo BMD piuttosto che dall’Etest (Fig. 1).
Tabella 1.
MIC90, intervallo MIC e accordo della categoria interpretativa per le MIC dell’Etest e della microdiluizione in brodo a 48 ore per otto agenti antimicrobici testati contro 26 isolati di Y. pestis in quattro siti di test (104 risultati di test)
| Agente antimicrobico | BMD MIC (μg/ml) | Etesta MIC (μg/ml) | MIC breakpointb | % categoria accordo (% errori minori) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MIC90 | Range | MIC90 | Range | S | I | R | ||
| Cloramfenicolo | 8 | 0.25-16 | 2 | 0.12-4 | ≤8 | 16 | ≥32 | 98 (2) |
| Ciprofloxacin | 0.12 | ≤0.03-0.5 | 0.06 | 0.008-0.12 | ≤0.25 | 99 (1)c | ||
| Doxycycline | 2 | 0,12-4 | 2 | 0.25-2 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Gentamicina | 1 | 0.06-4 | 1 | 0.12-1 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Levofloxacin | ≤0.06 | ≤0.06-0.12 | 0.06 | 0.008-0.12 | ≤0.25 | 100 | ||
| Streptomicina | 4 | 1-8 | 4 | 1-8 | ≤4 | 8 | ≥16 | 97 (3) |
| Tetraciclina | 2 | 0.25-4 | 2 | 0.25-4 | ≤4 | 8 | ≥16 | 100 |
| Trimetoprim-sulfametossazolo | 0.06 | ≤0.015-0.25 | 0.03 | 0.008-0.06 | ≤2 | ≥4 | 100 | |
Numeri di risultati MIC ottenuti utilizzando 48-h Etest e 48-h broth microdilution (BMD) per otto agenti antimicrobici testati contro 26 isolati di Y. pestis in quattro siti di test (n = 104). La diluizione più bassa testata da BMD è indicata per i casi in cui il valore era diverso dalla diluizione più bassa sull’asse x. I valori MIC di trimetoprim-sulfametossazolo indicano solo la parte di trimetoprim.
I due metodi sono meglio confrontati analizzando l’accordo essenziale (le percentuali di MIC entro ± 1 diluizione log2 per i due metodi). L’accordo essenziale per tutti i siti combinati (comprese le MIC fuori scala) era ≥90% per ciprofloxacina, doxiciclina, levofloxacina, streptomicina e tetraciclina. I valori per l’accordo essenziale per gentamicina, trimetoprim-sulfametossazolo e cloramfenicolo erano più bassi, rispettivamente all’88%, 78% e 35%. Tranne che per il cloramfenicolo e il trimetoprim-sulfametossazolo, c’era generalmente poca o nessuna variazione nell’accordo essenziale tra i siti per ogni farmaco (Tabella 3). Per il cloramfenicolo e il trimetoprim-sulfametossazolo, l’accordo essenziale tra i metodi MIC nei singoli siti variava dal 4% all’81% e dal 58% al 96%, rispettivamente.
Tabella 2.
Confronto delle MIC dell’Etest a 48 ore con quelle della microdiluizione in brodo a 48 ore per otto agenti antimicrobici testati contro 26 isolati di Y. pestis in quattro siti (104 risultati di test)
| Agente antimicrobico | No. di risultati con differenze di diluizione MIC log2 indicate tra Etest e il metodo di riferimento BMD | % di accordo essenzialeb (% incluso fuori scala MICs) | % di accordo essenzialeMIC fuori scala) | P valutato | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ≤-3 | -2 | -1 | 0 | +1 | +2 | ≥+3 | |||||
| Cloramfenicolo | 25 | 43 | 27 | 8 | 1 | 35 | <0.001 | ||||
| Ciprofloxacinc | 4 | 6 | 39 | 53 | 2 | 87 (90) | <0.001 | ||||
| Doxycycline | 1 | 14 | 48 | 35 | 6 | 93 | 0.03 | ||||
| Gentamicina | 1 | 2 | 18 | 47 | 26 | 5 | 5 | 88 | 0.03 | ||
| Levofloxacinc | 6 | 98 | 100 (100) | N/Ae | |||||||
| Streptomicina | 25 | 72 | 7 | 100 | N/A | ||||||
| Tetraciclina | 2 | 26 | 47 | 27 | 2 | 96 | 0.5 | ||||
| Trimetoprim-sulfametossazolo | 3 | 20 | 61 | 20 | 78 (78) | <0.001 | |||||
Tabella 3.
Confronto dell’accordo essenziale in quattro siti di test tra le MIC di Etest a 48 ore e le MIC di microdiluizione in brodo a 48 ore per otto agenti antimicrobici testati contro 26 isolati di Y. pestis isolati
| Sito(i) di test | % accordo essenziale | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CHL | CIP | DOX | GEN | LVX | STR | TET | SXT | |
| A | 4 | 85 | 100 | 81 | 100 | 100 | 100 | 85 |
| B | 4 | 92 | 96 | 77 | 100 | 100 | 100 | 73 |
| C | 81 | 100 | 85 | 96 | 100 | 100 | 92 | 96 |
| D | 50 | 85 | 92 | 96 | 100 | 100 | 92 | 58 |
| Tutti siti | 35 | 90 | 93 | 88 | 100 | 100 | 96 | 78 |
>Si
La gentamicina e doxiciclina Etest MICs erano significativamente (P = 0.03) superiori alle corrispondenti MIC del BMD (Tabella 2); tuttavia, i valori per l’accordo essenziale tra i metodi per ogni farmaco erano ancora buoni all’88% e al 93%, rispettivamente (Tabella 2). Le MIC di cloramfenicolo, ciprofloxacina e trimetoprim-sulfametossazolo Etest erano, in media, significativamente (P < 0,001) inferiori alle loro corrispondenti MIC BMD, e solo la ciprofloxacina aveva un accordo essenziale di ≥90%. Per levofloxacina, streptomicina e tetraciclina, non sono state osservate differenze statistiche tra Etest e BMD MICs.
Per la diffusione su disco, tutti i dischi antimicrobici tranne i dischi di streptomicina hanno prodotto zone di grande diametro; alcune zone hanno superato 40-50 mm di diametro (tabella 4) e si sono sovrapposte sulla piastra MHA. I margini delle zone per i farmaci che producevano queste grandi zone erano spesso confusi o indistinti. Due isolati in un sito di test avevano zone illeggibili per tutti i farmaci a causa della scarsa crescita a 24 ore. I dischi di cloramfenicolo e trimetoprim-sulfametossazolo occasionalmente producevano un effetto a doppia zona con un margine interno di crescita più chiaro, probabilmente a causa dell’attività statica del farmaco con questo organismo a crescita lenta. I dischi di streptomicina hanno prodotto la dimensione media più bassa (da 23 a 24 mm di diametro) della zona di inibizione del disco e le zone più distinte e leggibili. Le dimensioni delle zone degli altri tipi di dischi avevano un diametro medio da 30 a 42 mm a 48 ore, e i loro diametri erano più difficili da leggere.
Tabella 4.
Risultati della diffusione dei dischi per i test eseguiti utilizzando l’agar Mueller-Hinton e 26 isolati di Y. pestis in due sitia
| Disco antimicrobico (concn ) | Zona di inibizione diam (mm) per il periodo di incubazione indicato (h) | |||
|---|---|---|---|---|
| Range | Avg | |||
| 24 | 48 | 24 | 48 | |
| Cloramfenicolo (30) | 28-47 | 25-51 | 39 | 38 |
| Ciprofloxacina (5) | 30-51 | 30-53 | 42 | 42 |
| Dossiclina (30) | 26-40 | 26-41 | 33 | 33 |
| Gentamicina (10) | 24-36 | 22-42 | 29 | 30 |
| Levofloxacina (5) | 34-48 | 34-50 | 41 | 42 |
| Streptomicina (10) | 17-30 | 18-32 | 23 | 24 |
| Tetraciclina (30) | 27-40 | 26-39 | 32 | 33 |
| Trimetoprim-sulfametossazolo (1.25-23.75) | 34-50 | 34-49 | 43 | 42 |
In generale, c’era un buon accordo essenziale tra il metodo Etest e il metodo BMD di riferimento per il test di suscettibilità antimicrobica. Tuttavia, i tassi di accordo essenziale tra Etest e BMD per cloramfenicolo, gentamicina e trimetoprim-sulfametossazolo erano inferiori al minimo del 90% raccomandato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l’uso di un nuovo metodo nei test clinici (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).
Le differenze di intensità dell’illuminazione nella cabina di sicurezza biologica in ogni sito di test possono essere un fattore che contribuisce alla determinazione del punto finale. Abbiamo scoperto che la lettura di un endpoint Etest è più facile quando una lampada di lettura è collocata nella cabina per integrare la fonte di luce. Tutti i siti tranne il sito D hanno utilizzato questa fonte di luce supplementare per migliorare la leggibilità dei test di suscettibilità. Gli Etest su tetraciclina e doxiciclina, come quelli su cloramfenicolo e trimetoprim-sulfametossazolo, sono stati letti anche ad un endpoint dell’80%, ma non sono state notate doppie ellissi e l’accordo essenziale è stato ≥90% per entrambi i farmaci della classe tetraciclina, quindi sembra che questo fenomeno Etest vari in base alla classe di farmaci per Y. pestis.
Per la gentamicina, l’accordo essenziale complessivo è stato dell’88%, appena sotto il cutoff consigliato del 90%. Due siti hanno dimostrato un alto (96%) accordo essenziale, ma l’accordo era più basso (77% e 81%) per gli altri due siti. La ragione di questa variabilità è sconosciuta. Tuttavia, le distribuzioni complessive delle MIC di Etest e BMD sono simili (Fig. 1). È stato suggerito che, per i nuovi metodi di suscettibilità che vengono eseguiti con organismi a crescita lenta o fastidiosi, i test dovrebbero essere tenuti meno rigidamente a questo standard e che è ammissibile un accordo essenziale inferiore (14). Questa logica sembra appropriata per il gentamicin Etest, dato che l’accordo essenziale era dell’88%. L’accettabilità del trimetoprim-sulfametossazolo Etest al 78% di accordo essenziale non è chiara.
Un limite di questo studio è che non sono stati inclusi isolati con resistenza nota. L’accesso ai ceppi resistenti ai farmaci del Madagascar (3, 9-11) è limitato. Altre segnalazioni di resistenza ai farmaci in Y. pestis sono rare e i ceppi resistenti non sono ben caratterizzati (15, 16, 24). Pertanto, non abbiamo potuto valutare la capacità del metodo Etest di rilevare la resistenza nota in Y. pestis.
Il metodo di diffusione su disco non è raccomandato per Y. pestis a causa della difficoltà di leggere le zone di inibizione mal definite e grandi diametri di zona incontrati con la maggior parte dei farmaci testati. Il test con il disco della streptomicina può giustificare ulteriori studi se gli isolati resistenti alla streptomicina diventano accessibili, perché le dimensioni delle zone erano più piccole e più distinte di quelle ottenute con altri dischi.
In sintesi, in un confronto di due metodi MIC per il test di suscettibilità di Y. pestis, i risultati per tutti gli agenti antimicrobici erano ben correlati tra Etest e BMD, tranne che per il cloramfenicolo e il trimetoprim-sulfametossazolo, per i quali i punti finali erano difficili da determinare con Etest. C’era anche una maggiore variabilità da sito a sito per il cloramfenicolo e il trimetoprim-sulfametossazolo rispetto agli altri farmaci. Il metodo Etest sembra essere un’alternativa accettabile al BMD per ciprofloxacina, doxiciclina, gentamicina, levofloxacina, streptomicina e tetraciclina, ma non per cloramfenicolo e trimetoprim-sulfametossazolo. Poiché Y. pestis cresce lentamente su MHA, 48 ore di incubazione sono raccomandate per l’Etest. Tuttavia, poiché non siamo stati in grado di includere alcun ceppo di Y. pestis resistente ai farmaci nel nostro studio, si raccomanda anche che le MIC di Etest non suscettibili siano confermate da un test BMD MIC di riferimento. Consigliamo inoltre che il test BMD di conferma sia eseguito su qualsiasi isolato di Y. pestis con una ciprofloxacina o levofloxacina Etest MIC di 0,25 μg/ml, una MIC all’estremità superiore della gamma suscettibile, poiché non è noto se la resistenza emergente può essere rilevata per questi due farmaci dal metodo Etest.