Abstract

Il progresso del sequenziamento del genoma umano sta guidando approcci genetici per definire la funzione genica. Strategie come le trappole geniche e la mutagenesi chimica genereranno presto una grande risorsa di topi mutanti. Le mutazioni puntiformi indotte da N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) forniscono una risorsa mutante unica perché: (i) riflettono le conseguenze del cambiamento del singolo gene indipendente dagli effetti di posizione; (ii) forniscono una dissezione della struttura fine della funzione della proteina; (iii) mostrano una gamma di effetti mutanti dalla perdita completa o parziale della funzione alla funzione esagerata; e (iv) scoprono le funzioni del gene in modo imparziale. Gli schermi ENU guidati dal fenotipo nel topo stanno enfatizzando la rilevanza per la malattia clinica umana mirando alla cardiologia, fisiologia, neurologia, immunità, ematopoiesi e sviluppo dei mammiferi. Tali approcci sono estremamente potenti nella comprensione di malattie e tratti umani complessi: i cambiamenti di coppia di base possono modellare accuratamente i cambiamenti di base trovati nelle malattie umane, e gli alleli mutanti sottili in uno sfondo genetico standard forniscono la capacità di analizzare le conseguenze dei genotipi composti. Gli esperimenti di mutagenesi ENU in corso sui topi stanno generando un tesoro di nuove mutazioni per permettere uno studio approfondito di un singolo gene, una regione cromosomica o un sistema biologico.

Introduzione

Gli strumenti genetici manipolativi nel topo sono estesi e potenti. I genetisti del topo possono eliminare o sovraesprimere i geni nell’intero animale o in un tessuto specifico, introdurre grandi pezzi di DNA proprio o estraneo nel genoma e ingegnerizzare interi cromosomi. Queste tecniche, combinate con le somiglianze genetiche, di sviluppo, patologiche e fisiologiche tra il topo e l’uomo, hanno stabilito il topo da laboratorio come un organismo modello primario per la ricerca sulle malattie umane. I ceppi consanguinei di topi forniscono l’opportunità di studiare un tratto di malattia in un background genetico definito, permettendo la distinzione tra i fenotipi conferiti da una singola mutazione rispetto ai contributi di altri modificatori genetici.

La capacità di costruire mutazioni di perdita di funzione tramite ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali ha aperto la strada a una rivoluzione nella biologia del topo. Usando la tecnologia delle cellule staminali embrionali, qualsiasi gene coinvolto nella malattia umana può essere interrotto, fornendo preziose informazioni sulle conseguenze della mutazione nell’intero animale. Mentre le mutazioni nulle sono necessarie, le mutazioni sottili indotte da N-etil- N-nitrosourea (ENU) sono preziose per esaminare l’intera gamma di funzioni geniche. Le mutazioni nelle regioni codificanti e negli elementi regolatori possono produrre fenotipi molto diversi mentre forniscono una dissezione a struttura fine della funzione proteica e della regolazione genica. Le serie di alleli possono essere generate dalla ricombinazione omologa, ma la mutagenesi guidata dal fenotipo offre molti vantaggi nella velocità di generazione e nella rimozione dei bias del ricercatore. Pertanto, un database di knockout per il genoma del topo dovrebbe essere considerato solo come un punto di partenza; ulteriori alleli e specificità di tessuto sono obbligatori per completare l’analisi funzionale.

Mutagenizzare la linea germinale del topo

L’ENU può trasferire il suo gruppo etilico ai radicali di ossigeno o di azoto nel DNA, con il risultato di un mispairing e della sostituzione di coppie di basi se non riparato. I più alti tassi di mutazione si verificano nelle cellule staminali spermatogoniche pre-meiotiche, con frequenze di mutazione del singolo locus di 6–1.5 × 10 -3 ( 1-3 ), equivalente a ottenere una mutazione in un singolo gene di scelta in uno su ogni 175-655 gameti schermati. A causa del suo potere di isolare mutazioni in qualsiasi gene o regione di interesse, ENU è stato utilizzato nel topo per: (i) ottenere serie multialleliche di singoli geni per definire ulteriormente la funzione; (ii) sezionare percorsi biochimici o di sviluppo; (iii) ottenere nuove mutazioni recessive su un singolo cromosoma o genoma-wide; e (iv) saturare le regioni del genoma del topo che sono scoperte da delezioni ( 4-10 ). L’analisi di 62 mutazioni germinali sequenziate da 24 geni rivela che l’ENU modifica prevalentemente coppie di basi A/T, con il 44% di transizioni A/T→T/A, il 38% A/T→G/C, l’8% G/C →A/T, il 3% G/C→C/G, il 5% A/T→C/G e il 2% G/C→T/A ( Tabella 1; Fig. 1 ). Quando vengono tradotti in un prodotto proteico, questi cambiamenti risultano in 64% mutazioni missenso, 10% mutazioni non senso e 26% errori di splicing (Tabella 1; Fig. 1).

Poiché è un mutageno puntiforme, ENU può indurre molti tipi diversi di alleli. Mutazioni di perdita di funzione, ipomorfi vitali di gruppi di complementazione letali, antimorfi e mutazioni di guadagno di funzione sono stati isolati in schermi di mutagenesi del topo ( 4 , 9-16 ). Le serie di alleli a singoli loci sono estremamente potenti se analizzate insieme per definire la funzione. Serie alleliche a loci complessi possono interrompere singole isoforme proteiche, portando alla scoperta di funzioni distinte in vari tessuti durante la vita di un organismo ( 17 ). Un esempio eclatante di tale serie allelica è il locus quaking (qk). Prima dell’isolamento degli alleli indotti dall’ENU, il locus quaking era definito da un singolo allele spontaneo, qkV , con un fenotipo omozigote di convulsioni e tremori causati da una grave dismielinizzazione del sistema nervoso centrale (CNS) ( 18 ). Gli alleli indotti da ENU, tuttavia, rivelano che il quaking funziona anche durante l’embriogenesi ( 7 , 13 ). Gli omozigoti di quattro dei cinque alleli indotti dall’ENU (qk1-1, qkkt1, qkk2, qkkt3/4) muoiono nei giorni embrionali (E) 8.5-10.5 con difetti del SNC, mentre solo uno è vitale con tremori e convulsioni (qke5) (19; J.K. Noveroske e M.J. Justice, dati non pubblicati). Sebbene gli alleli quaking possano essere raggruppati in base alla letalità embrionale o alla dismielinizzazione vitale, ogni allele si discosta in qualche modo significativo da questi fenotipi generali per renderlo una risorsa unica e preziosa per gli studi di struttura/funzione fine e la modellazione dei difetti del tubo neurale umano, così come i disturbi di sequestro e mielinizzazione (Tabella 2). Serie alleliche generate da ENU o gene targeting ad altri loci complessi saranno strumenti preziosi per dissezionare la funzione della proteina ( 17 ).

Isoluzione di modelli di malattia usando ENU

Diversi schermi genetici possono essere usati per isolare mutazioni indotte da ENU. Uno schermo a generazione singola può generare rapidamente mutanti vitali e fertili che rappresentano serie di alleli, modificatori o mutazioni dominanti. Gli schermi di delezione a due generazioni possono identificare mutazioni letali recessive in una regione definita del genoma. Gli schermi con pedigree di tre generazioni possono essere usati per scansionare l’intero genoma per una mutazione vitale di interesse o, in combinazione con marcatori collegati o cromosomi equilibratori, per isolare alleli letali o sterili (vedi sotto).

Schermi su larga scala

Diversi schermi di mutagenesi su larga scala sono già stati finanziati a livello internazionale. Le caratteristiche chiave di questi schermi sono riassunte nella tabella 3. Ognuno di questi schermi utilizza una diversa strategia genetica per isolare le mutazioni: alcuni schermi mirano a mutazioni dominanti, mentre altri sono progettati per isolare mutazioni recessive. Alcuni gruppi stanno cercando mutazioni recessive letali e dannose con mutagenesi regionale per affrontare la funzione genica in parallelo con il Progetto Genoma Umano. Altri gruppi stanno analizzando un gran numero di genomi mutagenizzati per varianti neurologiche e cliniche dominanti o biochimiche.

Schermi su piccola scala

Lo screening delle mutazioni non deve essere effettuato su larga scala. Due strategie convenienti per i piccoli laboratori sono le serie alleliche e gli schermi di vie sensibilizzate. Uno schermo di percorso sensibilizzato ha come obiettivo un singolo percorso biologico o biochimico e sfrutta la non-complementazione allelica per isolare le mutazioni nella prima generazione di figli di maschi mutagenizzati. In uno schermo di questo tipo, una mutazione indotta (*) in un locus che interagisce con il locus di interesse (m) può fallire la complementazione (*/+;+/ m), ma produrre un fenotipo che ricorda il mutante omozigote originale (m/m). Alcuni schermi sensibilizzati possono essere eseguiti sullo sfondo di un farmaco o di una modifica ambientale, invece di una modifica genetica. Per esempio, utilizzando un’iniezione di fenilalanina come sensibilizzatore, un certo numero di mutazioni che interessano la via del metabolismo della fenilalanina sono state isolate come eterozigoti ( 20 , 21 ).

Combinazione di approcci guidati dal gene e dal fenotipo

Un approccio unico per isolare le mutazioni combina il targeting basato sul gene nelle cellule staminali embrionali con la mutagenesi ENU guidata dal fenotipo. Potenti strategie genetiche in Drosophila si basano sulla disponibilità di reagenti genetici come delezioni, duplicazioni e inversioni per facilitare gli schermi genetici e fornire un semplice ed economico mantenimento delle scorte. Le delezioni sono utili per generare aploidia negli schermi genetici, così come per la mappatura utilizzando strategie di non-complementazione (Fig. 2 B) (22). Le inversioni che portano un marcatore dominante e sono omozigoti letali sono cromosomi equilibratori ideali per sopprimere la ricombinazione e identificare facilmente classi di prole per l’isolamento e il mantenimento di mutazioni letali o dannose (Fig. 2 C). La capacità di ingegnerizzare intere regioni cromosomiche utilizzando tecnologie Cre /loxP permette la creazione di questi reagenti genetici in un processo di targeting genico in due fasi (Fig. 2 A) (23, 24). L’approccio è basato sul gene perché i punti finali della delezione o inversione sono noti, riducendo al minimo la quantità di sforzo richiesto per caratterizzare i riarrangiamenti. Le tecniche di ingegneria consentono di etichettare i riarrangiamenti con un marcatore dominante di colore giallo del mantello, K-14 agouti, fornendo una risorsa per la mappatura semplice, il mantenimento delle scorte e gli schermi genetici (22, 24, 25). La creazione di librerie genomiche del topo contenenti i costrutti necessari per gli eventi di targeting fornisce un sistema rapido per la loro generazione ovunque nel genoma del topo ( Fig. 2 A) ( 25 ).

Uno sforzo iniziale di mutagenesi, progettato per isolare mutazioni recessive di molte classi fenotipiche, ha come obiettivo il cromosoma 11 del topo, che è un cromosoma ricco di geni altamente conservato con il cromosoma 17 umano. L’obiettivo è quello di saturare il cromosoma con mutazioni per definire la funzione del gene, quindi utilizzare la conservazione del legame tra il topo e l’uomo per prevedere la funzione del gene nell’uomo. Usando i reagenti genetici generati dall’ingegneria Cre /loxP, si stanno eseguendo due schemi di mutagenesi: pedigree di delezione a due generazioni (Fig. 2 B) e pedigree a tre generazioni usando cromosomi bilanciatori (Fig. 2 C). Entrambi gli schemi sfruttano il colore giallo del mantello conferito dal transgene K14-agouti. Lo schema di delezione può essere utilizzato solo per le delezioni di grandi dimensioni che non sono dannosi per l’animale, limitando lo schermo a determinate regioni, ma permettendo mutazioni da isolare in solo due generazioni. Lo schema dell’inversione permette una porzione più grande del cromosoma da esaminare per le mutazioni, ma richiede tre generazioni di allevamento.

Identificazione delle mutazioni puntiformi

Per avere valore, le nuove mutazioni devono essere localizzate in modo da poter identificare i geni candidati e i modelli di malattie umane rilevanti. Le mutazioni puntiformi isolate dal loro fenotipo devono essere mappate usando le informazioni del fenotipo, dato che un’etichetta molecolare non è disponibile. Tradizionalmente, queste mutazioni sono mappate in backcrosses meiotici che segregano il fenotipo relativo a polimorfismi molecolari multipli (per una revisione vedi rif. 26). Per mappare ad una risoluzione di 10 cM richiede l’analisi di 100 meiosi. Quindi, 100 nuove mutazioni isolate a livello genomico richiederebbero l’analisi di 10 000 topi. Le strategie di mappatura ad alta risoluzione per il clonaggio posizionale di solito comportano l’analisi di 1000-2000 meiosi per mutazione. Una moltitudine di mutazioni dominanti e recessive può essere isolata in qualsiasi schermo ENU, rendendo la mappatura il collo di bottiglia del processo e richiedendo tecnologie di mappatura più semplici come il DNA pooling ( 27 ). Gli schermi con tag del colore del mantello descritti sopra sono unici in quanto la mutazione viene isolata legata a marcatori cromosomici visibili, quindi la sua posizione cromosomica è nota al momento dell’isolamento, eliminando la necessità di mappatura meiotica. Inoltre, le delezioni generate da Cre /loxP possono essere utilizzate per localizzare le mutazioni in una regione subcromosomica mediante non-complementazione ( 22 , 28 ). Poiché la sequenza del genoma del topo sarà presto disponibile, molte mutazioni saranno assegnate a geni basati sulla candidatura posizionale dopo la loro localizzazione. Inoltre, la complementazione BAC può essere utilizzata per identificare le correlazioni mutazione-gene ( 29 ).

Con lo sviluppo di nuove tecnologie per il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide ad alta produttività, le tecnologie per il rilevamento di mutazioni puntiformi diventeranno più semplici ( 30 , 31 ). A differenza degli esseri umani, i polimorfismi naturali sono rari nei ceppi inbred di topi, in particolare nelle regioni codificanti. Quindi, l’individuazione delle mutazioni puntiformi è possibile in un ceppo inbred background, rendendo l’individuazione delle mutazioni con enzimi di riparazione del mismatch un potenziale approccio per mappare e identificare rapidamente le lesioni.

Screening per i fenotipi di malattia

In qualsiasi ricerca di mutazioni usando ENU, l’isolamento delle mutazioni si basa sul test del fenotipo, richiedendo che il fenotipo mutante vari significativamente dal background. Tuttavia, lo screening delle mutazioni comporta l’analisi di molti animali, quindi gli schermi fenotipici devono essere ampi e poco costosi. I fenotipi visibili che influenzano l’occhio, il mantello, la dimensione o il comportamento neurologico sono semplici da identificare, e tali schermi spesso producono nuove mutazioni. I fenotipi del comportamento e degli organi sensoriali possono essere analizzati usando test standard per i riflessi, la perdita della vista o dell’udito, lo sviluppo motorio, l’equilibrio e la coordinazione, così come l’apprendimento e la memoria. Lo sviluppo scheletrico e la morfologia dei tessuti molli possono essere esaminati usando l’analisi dei raggi X ad alta risoluzione e a bassa energia. I test clinici eseguiti sul sangue dei topi possono produrre una vasta gamma di fenotipi rilevanti per la malattia clinica umana, anche se i test eseguiti sui fluidi corporei dei topi devono essere eseguiti su una microscala. A causa dei test su microscala esistenti per i neonati umani, molti test clinici sono già disponibili. Un conteggio completo del sangue con analisi differenziale microscopica può identificare anomalie nel numero o nella morfologia dei globuli rossi e dei globuli bianchi, così come anomalie delle piastrine. Estendere l’analisi delle cellule del sangue con la citometria a flusso può scoprire altri difetti immunologici. La quantificazione degli anticorpi antinucleari può rilevare gli autoanticorpi nel siero in una grande varietà di disturbi autoimmuni, compreso il lupus eritematoso sistemico. I test di chimica clinica possono diagnosticare anomalie di sistemi d’organo multipli, compresi i disturbi del fegato, del pancreas, del cuore e dei reni. L’analisi delle urine sui topi rivela livelli aumentati di proteine o altri sottoprodotti anomali della malattia. La spettrometria di massa tandem può rilevare una varietà di disturbi metabolici che interessano i lipidi, gli acidi grassi o gli aminoacidi. Ulteriori saggi sono in fase di sviluppo per identificare fenotipi neurologici, cardiovascolari, ematopoietici e immunitari usando tecnologie high-throughput come i microarray.

Generazione di risorse per topi mutanti

La generazione di un gran numero di mutazioni creerà nuovi problemi etici e scientifici all’interno della comunità dei topi: saranno necessari nuovi database e saggi fenotipici, il recupero delle mutazioni a costi contenuti da sperma criopreservato o liofilizzato diventerà essenziale, e sorgeranno problemi di cura e costo degli animali. Questi sforzi richiedono un enorme investimento nelle risorse del topo.

Risorse genetiche

Una delle risorse genetiche più potenti attualmente disponibili nel topo sono i ceppi inbred. Definire ulteriormente la diversità genetica in questi ceppi è una delle priorità della comunità del topo, con sforzi in corso per sviluppare un database delle caratteristiche del ceppo. Questo richiede l’analisi dei ceppi inbred per molti parametri fenotipici, tra cui ematologia e chimica clinica, patologia, comportamento e fisiologia.

Il mantenimento, l’analisi e la mappatura di un gran numero di mutazioni del topo richiederà la generazione di risorse genetiche per abbassare i costi e ridurre gli errori. Reagenti genetici come le delezioni sono in fase di sviluppo con una varietà di metodi tra cui Cre/ loxP e radiazioni ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). I cromosomi equilibratori possono attualmente essere generati in modo rapido ed efficiente utilizzando approcci Cre / loxP ( 24 , 25 ). I topi transgenici contenenti YACs o BACs umani possono essere utili negli studi di complementazione e salvataggio ( 34 ). Poiché i fenotipi mutanti possono variare su diversi ceppi inbred, i reagenti genetici dovrebbero anche essere mantenuti su sfondi genetici standard.

Archiviazione

La generazione di un gran numero di stock di topi richiede un’efficiente archiviazione e ricostituzione degli stock. Lo stoccaggio di embrioni di topo tramite crioconservazione è una tecnica efficace che è già stata utilizzata per oltre un decennio. Recentemente, i successi nella crioconservazione dello sperma l’hanno resa una tecnica praticabile ( 35-37 ). In particolare, lo sperma di topo può essere utilizzato per ricostituire i ceppi con una serie di tecnologie di riproduzione assistita: inseminazione artificiale, fecondazione in vitro e iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI) ( 38 ). La ricostituzione con successo di ceppi di topo da sperma liofilizzato usando l’ICSI può fornire un altro metodo per archiviare e far rivivere i ceppi di topo ( 39 ).

Basi di dati

Le basi di dati sono già necessarie per gestire i dati genetici e fenotipici dei topi. Il principale database dei topi è il Mouse Genome Database ospitato presso il Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ), che include un Mouse Locus Catalogue che descrive i mutanti del topo esistenti e contiene ampie informazioni sulle mappe che descrivono le loro posizioni. Per semplificare la ricerca di topi mutanti, è stato recentemente sviluppato l’International Mouse Strain Resource ( 40 ), che è rispecchiato in due siti web: il Jackson Laboratory a www.jax.org/pub-cgi/imsrlist e il MRC, Harwell, a imsr.har.mrc.ac.uk/. Inoltre, è probabile che si accumulino grandi quantità di dati fenotipici su un gran numero di ceppi di topi mutanti, creando la necessità di database di fenotipi che possono essere collegati con database di mappatura e mutagenesi.

Distribuzione

Per fornire una risorsa genetica alla comunità, i topi mutanti devono essere facilmente disponibili. Anche se molti stock di mutanti sono disponibili da fornitori commerciali o dal Jackson Laboratory, sono necessari ulteriori centri di distribuzione. Per soddisfare questa domanda, diversi Mutant Mouse Resource Centers finanziati dal NIH serviranno come archivi di stock e centri di distribuzione per le varie regioni degli USA. L’Archivio europeo dei topi mutanti con nodi a Monteretondo (Roma, Italia), il CNRS (Orleans, Francia), l’Istituto Gulbenkian (Lisbona, Portogallo) e l’Istituto Karolinska (Huddings, Svezia) è una risorsa per gli sforzi europei. Questi centri di risorse sono progettati per distribuire tutti i tipi di ceppi di topi mutanti.

Il futuro sembra luminoso

Un gran numero di stock di topi mutanti sarà generato nel prossimo decennio che includerà topi che portano delezioni, duplicazioni, cromosomi bilanciatori, interruzioni mirate, trappole geniche, inserzioni retrovirali o transgeniche, e mutazioni puntiformi. La compilazione di queste mutazioni in una risorsa di topi mutanti richiederà di raffinare la loro posizione nella mappa del topo e di prevedere la loro posizione nell’uomo. Le mutazioni genereranno una mappa funzionale del genoma che può essere correlata con la sequenza e la mappa delle trascrizioni per fornire una ricca risorsa di informazioni funzionali (Fig. 3). Un gran numero di mutazioni indotte da ENU sono già state prodotte che rappresentano solo una frazione del potenziale mutazionale del genoma dei mammiferi, e ulteriori esperimenti genereranno nuovi modelli di malattie umane e riveleranno nuovi percorsi di sviluppo dei mammiferi. La nostra visione della funzione genica nei mammiferi sarà drammaticamente e permanentemente cambiata da questi esperimenti, che avranno un grande impatto sullo sviluppo dei farmaci e sulla salute umana.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Yin-Chai Cheah per l’assistenza nel finalizzare il manoscritto. Il lavoro su Chromosome 11 è finanziato dalla sovvenzione P01 CA75719 del Dipartimento della Salute Pubblica degli Stati Uniti. A.B. è un ricercatore dell’Howard Hughes Medical Institute.