3.4 Modificación de la inosina y rotación del ARNm
La modificación de la adenosina en inosina (A-I) de los ARNm es catalizada por las adenosina deaminasas que actúan sobre las enzimas del ARN (ADARs). Estas enzimas tienen preferencia por las regiones de ARN de doble cadena, y la conversión de A-I (también descrita como edición en esta sección) cambiará las propiedades de emparejamiento de bases de las bases modificadas, ya que ahora se emparejarán de forma similar a la guanina. Como se hizo anteriormente, separaremos los efectos directos de la inosina sobre la estabilidad del ARNm de los que surgen de los efectos indirectos. La introducción de inosina en las regiones de doble cadena del ARN puede desencadenar su degradación mediante el reclutamiento de ribonucleasas específicas para los ARN que contienen inosina. La primera enzima que se propuso como mediadora de este efecto es la nucleasa estafilocócica de Tudor (SN), que se demostró que promueve la ruptura de ARN de doble cadena hipereditados en extractos . La mayoría de los resultados descritos en este estudio demuestran una actividad bioquímica de la Tudor-SN sobre sustratos hipereditados in vitro. Sin embargo, no está claro a partir de estos estudios qué fracción de ARNm que contienen inosina están sujetos a la escisión por Tudor-SN in vivo, y si Tudor-SN fue o no la endonucleasa directa. La Tudor-SN se localiza en los gránulos citoplasmáticos de estrés, por lo que es posible que algunos de sus transcritos objetivo estén regulados preferentemente durante las condiciones de estrés. La segunda nucleasa conocida por ser específica para los ARN que contienen inosina es la endonucleasa humana V (hEndoV), que puede escindir una variedad de sustratos de ARN que contienen inosina in vitro. Un estudio sugirió que la hEndoV es la verdadera endonucleasa de inosina, y que la Tudor-SN proporciona una actividad estimulante a la hEndoV . Curiosamente, la hEndoV también se localiza en los gránulos de estrés del citoplasma, lo que sugiere una función similar a la de la Tudor-SN en la regulación potencial de los niveles de ARNm que contienen inosina durante el estrés. En general, aunque está claro que existen actividades de nucleasas específicas de inosina en las células eucariotas (Fig. 5), su contribución al corte y al recambio de ARNm sigue siendo poco conocida. Por lo tanto, el impacto fisiológico del corte del dsRNA hipereditado por Tudor-SN y/o hEndoV necesita ser explorado más a fondo.
Las enzimas ADARs también pueden jugar un papel importante en la estabilidad del mRNA regulando la unión de las proteínas de unión al RNA que influyen en el decaimiento del mRNA. La influencia de las ADARs en el nivel de sus ARNm objetivo se midió globalmente, y en general su impacto en los niveles de ARNm no se correlaciona bien con su capacidad para promover la formación de inosina en estos ARNm . Más bien, parece que el principal impacto de los ADARs en la estabilidad del ARNm es a través del reclutamiento de la proteína de unión al ARN HuR (ELAVL1), que es un importante regulador de la decadencia del ARNm. ADAR1 interactúa con HuR de manera dependiente del ARN, y la mayoría de los ARNm regulados a la baja en ausencia de ADAR1 contienen sitios de unión a HuR . Por lo tanto, ADAR1 parece influir en la estabilidad de sus objetivos de ARNm a través del reclutamiento de HuR a los sitios objetivo situados en las proximidades. Los ADARs también pueden regular los niveles de varios mRNAs y ncRNAs previniendo la unión del factor de decaimiento PARN, que es una nucleasa específica de poli(A). Esta función también parece ser independiente de la edición, ya que un mutante ADAR catalíticamente inactivo es capaz de cumplir las funciones de la enzima en el control de la descomposición. Por lo tanto, el impacto de los ADARs en la estabilidad de sus objetivos de ARNm parece ser principalmente independiente de su capacidad para promover la formación de inosina.
Una consecuencia importante de la modificación de la inosina en el recambio del ARNm se debe al impacto de la inosina en la regulación génica mediada por el microARN. La presencia de inosina puede influir en dos pasos principales de esta vía (i) la biogénesis de los microARN y (ii) la especificidad de la orientación de los ARNm por los microARN. En cuanto al impacto de la inosina en la biogénesis de los microARNs, se ha demostrado que los precursores primarios de los microARNs pueden ser editados por ADAR1 o ADAR2 . La presencia de inosina en estos precursores tiene dos efectos perjudiciales en la producción de microRNAs maduros . En primer lugar, la inosina reduce la eficiencia del procesamiento de los precursores primarios por parte de Drosha; en segundo lugar, los precursores que contienen inosina se convierten ahora en una diana para las ribonucleasas específicas de la inosina, como Tudor-SN y/o hEndoV. Estos efectos combinados de la modificación de la inosina en los precursores primarios de los microARNs resultan en una disminución de los niveles de microARNs producidos a partir de estos precursores, con un aumento concomitante de los ARNm objetivo. Este proceso puede ser regulado, ya que se demostró que los precursores del microARN miR-151 son editados durante el desarrollo temprano, lo que resulta en la degradación del precursor por Tudor-SN . De forma más general, los precursores de microARNs que contienen inosina se degradan durante las etapas postzigóticas en ratones . Estos resultados muestran que la edición A-I de los precursores de microARNs puede regular su biogénesis durante el desarrollo, lo que a su vez afecta directamente a la expresión de sus objetivos de ARNm. Sin embargo, el efecto de los ADARs en la biogénesis de los microARNs es complejo porque también se ha demostrado que ADAR1 se heterodimeriza con la enzima RNasa III Dicer para aumentar la eficiencia del procesamiento de los microARNs , desempeñando así un papel positivo en la biogénesis de los microARNs. La complejidad de los efectos directos e indirectos de los ADAR en la biogénesis de ARN pequeños también se demostró en todo el genoma de Caenorhabditis elegans. Por último, ADAR1 también puede unirse a siRNAs independientemente de la edición de RNA en células de mamíferos, lo que limita la eficacia del tratamiento con siRNA . Por lo tanto, los ADARs parecen ser un arma de doble filo para el silenciamiento génico mediado por microARNs y pequeños ARNs, ya que el efecto supresor de la modificación de la inosina sobre el procesamiento y la estabilidad de los precursores de microARNs puede ser contrarrestado por la capacidad de los ADARs de promover el procesamiento de microARNs a través de su asociación con Dicer, y su efecto sobre la disponibilidad de siRNAs. Sin embargo, estas enzimas desempeñan funciones clave en el control de la diferenciación celular a través de la edición de los precursores de microARN. Por ejemplo, se demostró que la hiperedición del precursor de microARN Let-7 por parte de ADAR1 en la leucemia promueve la renovación de las células madre de la leucemia, lo que pone de manifiesto la importancia de afinar la edición de los precursores de microARN durante la diferenciación celular.
La inosina también influye en la regulación del ARNm mediada por el microARN afectando a la formación del dúplex de ARN, que es fundamental para determinar la especificidad de las interacciones microARN-ARNm (Fig. 5). Esto se demostró por primera vez al mostrar que la introducción de inosina en el microARN miR-376 daba lugar a la represión de un grupo diferente de ARNm en relación con los reprimidos por el miR-376 no modificado. Si el sitio editado reside en la secuencia semilla del microARN, la modificación resulta en un cambio de especificidad para los microARNs porque la inosina se empareja preferentemente con la C. Recíprocamente, la edición de A-I en las secuencias 3′-UTR de los ARNm cambiará el objetivo potencial de estos UTRs por los microARNs y puede crear nuevos sitios de unión a los microARNs . Se ha demostrado que la edición regulada es potencialmente importante en la regulación de oncogenes y genes supresores de tumores a través de microARNs durante la transformación celular.
Por último, la inosina puede influir en la estabilidad del ARNm a través de efectos indirectos. Se ha descubierto que los ARNm que contienen inosina están restringidos al núcleo en las células inmunitarias estimuladas por LPS, lo que impide su exposición a la maquinaria de descomposición del ARNm citoplásmico. La retención nuclear de estos ARNm, sin embargo, los sometería a una degradación preferente por vías de degradación nuclear como el exosoma nuclear. Esto puede resultar en un aumento o disminución de la estabilidad, dependiendo de la eficiencia relativa de cada una de estas vías de degradación en ARNm específicos. La inosina también influye en el splicing alternativo, que a su vez podría dar lugar a isoformas de ARNm con diferentes estabilidades. Esto es especialmente cierto si las especies empalmadas alternativamente contienen sitios de unión para distintas proteínas de unión al ARN que modulan su estabilidad. Por lo tanto, la inosina y los ADARs pueden afectar a la estabilidad y expresión del ARNm de muchas maneras a través de una combinación de efectos tanto directos como indirectos.