Resultados

Análisis de muestras clínicas.

En septiembre de 2006, se aisló el virus de la gripe A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) en varios cerdos de 5 a 6 semanas de edad con bronconeumonía multifocal en un criadero comercial de cerdos de varias procedencias. Las lesiones pulmonares incluían bronconeumonía moderada, subaguda a crónica, purulenta y neumonía intersticial con bronquiolitis y peribronquitis. El tejido pulmonar fue negativo para el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae, pero fue positivo para Streptococcus suis. Debido a las lesiones características parecidas a las de la gripe y a los signos clínicos de neumonía, se inoculó un homogeneizado de tejido pulmonar en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). Se detectaron efectos citopáticos en el día 3 postinoculación (p.i.). Se detectó el gen de la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe en las células infectadas mediante RT-PCR. El virus no reaccionó con los antisueros porcinos de referencia (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) en los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (IH), y la RT-PCR múltiplex no detectó genes H1N1 o H3N2 (14). El virus se envió al Centro Nacional de Enfermedades Animales (NADC) en febrero de 2007 para su subtipificación y secuenciación.

Después de que se subtipificara y secuenciara el aislado de septiembre (descrito a continuación), una búsqueda de registros de casos reveló que se había enviado otro aislado de gripe «no tipificable» en abril de 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) se había aislado de un cerdo de 12 semanas con enfermedad respiratoria en otra granja comercial de cerdos de engorde. Las lesiones pulmonares eran histopatológicamente características de la gripe porcina (inflamación grave y subaguda de los alvéolos y bronquios con necrosis de las células epiteliales bronquiolares y metaplasia). El pulmón fue negativo para PRRSV, PCV2 y M. hyopneumonia, pero fue positivo para el virus de la gripe A por RT-PCR (específico para el gen NP) y para S. suis. El virus se envió al NADC en marzo de 2007 para su subtipificación y secuenciación.

Subtipificación y análisis filogenético.

Para identificar y caracterizar ambos virus de la gripe, se llevó a cabo la secuenciación del ácido nucleico y el análisis molecular y filogenético. Ambos virus se secuenciaron directamente a partir de aislados de bajo paso utilizando células MDCK, y las secuencias se confirmaron tras la purificación en placa y la resecuenciación. Se identificaron como virus H2N3 mediante la secuencia de nucleótidos y una búsqueda BLAST en la Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). El segmento del gen HA del Sw/4296424 era el que más se parecía a los de los virus H2 aislados en ánades reales en Norteamérica. Su segmento NA estaba estrechamente relacionado con el de un virus de la gripe aviar (AIV) H4N3 aislado en cerceta de alas azules (98,3% de identidad). A excepción del gen de la polimerasa ácida (PA), sus genes internos procedían de los virus contemporáneos de la gripe porcina de triple importancia que se encuentran actualmente en Estados Unidos. Estos virus llevan genes internos de origen humano (PB1), aviar (PB2, PA) y del virus de la gripe porcina (SI Tabla 4). Su segmento PA era idéntico en un 99,2% al del virus de la gripe aviar H6N5 aislado en ánades reales (Tabla SI 4). Los virus Sw/2124514 y Sw/4296424 mostraron una identidad de secuencia nucleotídica total del 99,3 al 99,9% (Tabla SI 5). Ambos aislados fueron clonados repetidamente en placa, reexaminados y confirmados por secuenciación como pertenecientes al subtipo H2N3. El subtipo H2N3 se confirmó serológicamente mediante ensayos de inhibición de la hemaglutinación y de la neuraminidasa. El análisis filogenético basado en los genes HA y NA demostró que estos dos virus pertenecen al linaje aviar americano que es distinto de las cepas aviares euroasiáticas y de los virus H2N2 aislados en humanos tras la pandemia de gripe de 1957 (Fig. 1).

Análisis molecular de las proteínas de superficie HA y NA.

Los virus de la gripe A contienen dos proteínas de superficie: la HA es la glicoproteína de unión al receptor y de fusión con la membrana, y la NA es una enzima destructora del receptor. La HA viral es un factor crítico de la especificidad de los virus de la gripe con respecto a la especie huésped (15). Para caracterizar los residuos dentro de la HA que pueden estar asociados con la adaptación de un virus aviar al huésped mamífero, comparamos las secuencias de aminoácidos de las HA porcinas con las de los supuestos virus aviares de referencia. La comparación molecular de las moléculas de HA de los dos aislados del H2N3 porcino reveló que difieren del virus H2N3 putativo de referencia aislado de ánades reales por seis sustituciones de aminoácidos comunes (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I y L506V) (Tabla SI 6). La sustitución Q226L se encontró en los dos aislados H2N3 porcinos, mientras que la posición 228 contenía G, idéntica a la secuencia consenso aviar (Tabla 1) (16). En cambio, las moléculas de HA humanas del subtipo H2 contienen 226L y 228S, mientras que los primeros aislados H2 humanos contienen 226L y 228G (Tabla 1), de forma similar a los aislados porcinos. Las posiciones 36N, 274I, 316I y 419I son exclusivas de los dos aislados H2N3 porcinos (Tabla SI 6), mientras que las posiciones respectivas en los aislados humanos y aviares representados en la Fig. 1 a son 36D, 274T, 316V y 419L. Para los aislados de la gripe representados en la Fig. 1 a, la posición 506V se conserva entre los humanos, dos aislados H2N3 porcinos y los aislados aviares, excepto para A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), como se muestra en la Tabla SI 6. Se encontraron dos cambios de aminoácidos comunes en la secuencia de aminoácidos de la NA de los dos aislados porcinos cuando se compararon con el virus H4N3 de referencia aislado de la cerceta de alas azules: H47Y y H253Y (Tabla SI 7). La posición 47Y en ambos aislados H2N3 porcinos es la misma que el aminoácido respectivo en los aislados aviares euroasiáticos representados en la Fig. 1 b; por el contrario, la posición en los aislados aviares norteamericanos es 47H. La posición 253Y es exclusiva de los aislados H2N3 porcinos, y la posición 253H se conserva en los aislados aviares euroasiáticos y norteamericanos representados en la Fig. 1 b. Curiosamente, Sw/4296424 (H2N3), aislado 5 meses más tarde que Sw/2124514 (H2N3), tenía dos sustituciones adicionales (P162S y L321V) en la molécula de la HA, y tenía tres sustituciones adicionales (V30I, I49T y A135T) en la molécula de la NA cuando se comparaba con la HA y la NA de Sw/2124514 (Tablas SI 6 y 7). La posición 30I (Sw/4296424) en la molécula de NA es similar a la de los aislados euroasiáticos, mientras que la posición 30V (Sw/2124514) se conserva en los aislados aviares norteamericanos.

Patogenicidad y transmisibilidad de los virus de la gripe porcina H2N3 en cerdos.

Para investigar el grado de adaptación porcina del virus H2N3, investigamos su patogenicidad en este huésped inoculando 20 cerdos de 4 semanas de edad con 2 × 106 dosis infectivas de cultivo de tejidos (TCID50) del virus Sw/4296424. Sólo se eligió un virus H2N3, debido a la gran identidad entre los dos aislados. Doce cerdos de control fueron inoculados de forma simulada con sobrenadante de cultivo celular no infeccioso. Se evaluó la transmisibilidad mediante el cohousing de 10 cerdos de contacto de la misma edad con los cerdos inoculados, a partir del día 3 p.i. Todos los cerdos utilizados para el estudio fueron seronegativos en el día 0 para los anticuerpos contra los virus de la gripe porcina H1N1, H1N2, H2N3 y H3N2 mediante el ensayo HI. Cinco cerdos inoculados y tres cerdos de control fueron eutanasiados para la necropsia en los días 3, 5 y 7 p.i. Los 10 cerdos de contacto y los 5 cerdos inoculados con el virus fueron sometidos a pruebas serológicas mediante el ensayo HI con H2N3 el día 24 después del contacto o el día 27 p.i., respectivamente. No se observaron signos respiratorios agudos. La necropsia reveló lesiones pulmonares macroscópicas graves (áreas consolidadas de color ciruela) en los cerdos inoculados, pero no reveló ninguna en los cerdos de control (Tabla 2). La puntuación histopatológica (0-3) que expresa el grado de daño a la arquitectura pulmonar fue >2 en los cerdos inoculados (Tabla 2). Los pulmones de los cerdos inoculados a los que se les practicó la eutanasia el día 3, 5 o 7 p.i. presentaban una neumonía intersticial de leve a moderada y una bronquiolitis necrotizante de aguda a subaguda con un ligero manguito linfocítico en los bronquiolos y vasos (Fig. 2). El virus se tituló en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y se aisló de muestras de hisopos nasales. Los títulos del virus en el pulmón oscilaron entre 104,3 y 106,5 DICT50/ml en los días 3 y 5 p.i. (SI Tabla 8) y fueron negativos en el día 7 p.i. En el grupo inoculado con H2N3, el virus se aisló de muestras de hisopos nasales en el 25% (5 de 20) de los cerdos en el día 3, en el 67% (10 de 15) en el día 5 y en el 20% (2 de 10) en el día 7 p.i.; en el grupo de contacto, el 10% (1 de 10) de las muestras fueron positivas en los días 5 y 7 después del contacto. En cambio, el 100% (10 de 10) de los cerdos de contacto fueron seropositivos tras 24 días de contacto con los cerdos inoculados (SI Tabla 9). Algunos cerdos de control presentaron un pequeño foco ocasional de neumonía intersticial leve (Tabla 2), pero fueron negativos a la infección por el virus de la gripe porcina. Todos los cerdos fueron negativos para el PRRSV y M. hyopneumoniae por PCR. Nuestros resultados indican que el virus H2N3 es patógeno en los cerdos y es transmisible entre ellos.

Patogenicidad de los virus de la gripe porcina H2N3 en ratones.

Para probar la capacidad del virus H2N3 Sw/4296424 de replicarse en ratones, inoculamos intranasalmente a ratones BALB/c de 6 a 7 semanas de edad con 102-106 TCID50. Los ratones inoculados con 104 TCID50 o más mostraron signos de enfermedad (por ejemplo, respiración dificultosa, pelaje áspero, pérdida de peso y letargo) (Tabla SI 10). El 75% de los ratones que recibieron 106 DICT50 murieron, pero no hubo muertes con dosis más bajas. Se detectó ARN viral mediante RT-PCR en tiempo real (17) en los pulmones de los ratones tras la inoculación con 106 o 105 DICT50 (SI Tabla 10). Histopatológicamente, el virus H2N3 indujo focos múltiples o coalescentes de neumonía intersticial y alveolitis proliferativa caracterizada por una prominente hipertrofia de los neumocitos y la infiltración de las paredes alveolares con una población mixta de macrófagos, linfocitos y neutrófilos (SI Fig. 3). Algunos lúmenes alveolares contenían coágulos de fibrina y ligeros exudados leucocitarios mixtos. En conjunto, estos hallazgos indican que el H2N3 es patógeno en ratones sin adaptación previa.

Transmisibilidad del virus de la gripe porcina H2N3 en hurones.

Para causar una pandemia, un virus emergente de la gripe A debe infectar a los humanos y transmitirse eficazmente entre ellos. Para investigar el potencial de transmisión del virus H2N3 reordenado en sistemas de mamíferos, utilizamos el modelo de contacto con hurones (18). Tres hurones de 18 semanas de edad, alojados en jaulas separadas, fueron inoculados con 102,5 TCID50 del virus H2N3 Sw/2124514. Después de 24 h, se colocó un animal de contacto en cada jaula. Se realizaron lavados nasales los días 1, 4 y 7 p.i. y se tituló el virus en los huevos embrionados. Se detectó el virus en todos los hurones inoculados y de contacto, pero ninguno mostró signos clínicos evidentes (Tabla 3). Estos resultados indican que el virus de la gripe H2N3 infectó a los hurones y se transmitió por contacto de forma eficiente.

Investigación serológica de los virus de la gripe porcina H2N3 en las granjas afectadas.

Para investigar más a fondo la propagación de los virus H2N3, realizamos un estudio serológico limitado de los animales asociados a los dos sistemas de producción afectados. En el primer estudio, en la primavera de 2007, se tomaron muestras de suero de cerdas de cuatro granjas que proporcionaron lechones a las granjas de cría durante el brote de septiembre de 2006. El 90% (54 de 60) fueron seropositivos a la presencia de anticuerpos contra Sw/4296424 (SI Tabla 11). Varios de los animales analizados estaban presentes en el momento del caso índice, y no está claro si estaban infectados en ese momento o si se infectaron posteriormente. Sin embargo, los datos muestran que el virus estaba presente tanto en las granjas de cerdas como en los viveros y que el virus se transmitió eficazmente entre los animales. Todas las cerdas de esta operación tenían títulos de anticuerpos >1:40 frente a los virus de la gripe porcina H1N1 y H3N2, ya que habían sido vacunadas previamente con una vacuna bivalente de gripe muerta H1N1 y H3N2.

También se recogieron muestras de suero en la primavera de 2007 de 30 cerdas y 90 cerdos destetados asociados al brote de abril de 2006, y se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos frente a Sw/2124514 mediante el ensayo HI. De las 30 cerdas y 90 cerdos destetados muestreados, 1 de 30 y 26 de 90 fueron seropositivos (SI Tabla 11), respectivamente.