Crecimiento y producción de etanol de S. cerevisiae NCYC 2826 sobre hidrolizado de paja de trigo

La figura 1A muestra el crecimiento de S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 cultivado a 30°C durante 36 h en un cultivo que contenía un hidrolizado con una concentración de glucosa de 123 mM preparado como se describe en la sección «Métodos». Se eligió la cepa S. cerevisiae por su alta tolerancia al etanol y su robustez en las fermentaciones industriales. La figura 1A muestra que cuando S. cerevisiae NCYC 2826 se cultivó sólo con hidrolizado de paja de trigo, se produjo una tasa de crecimiento lento μ de 0,036 h-1 y una densidad óptica (DO) final de 0,8. La adición de base nutritiva de levadura (YNB) al medio provocó un aumento de la μ a 0,135 h-1 y una DO final de 1,5, mientras que la adición de 2,3 mg ml-1 de urea al hidrolizado de paja de trigo dio una μ de 0,99 h-1 y una DO final de 1,3. Estudios anteriores han demostrado que los suplementos de urea pueden aumentar la producción de etanol en la fermentación de la levadura y que la propia urea es un componente esencial en los medios de crecimiento de levadura más mínimos . Nuestros resultados apoyan estos hallazgos anteriores, confirmando la necesidad de urea para un crecimiento casi óptimo de la levadura. Después de 36 h, se midió la concentración de etanol en los cultivos y el rendimiento de etanol obtenido a partir de 123 mM de glucosa fue aproximadamente el 90% del rendimiento teórico total para todos los cultivos. Aunque el etanol se produjo con un rendimiento comparable bajo estas tres condiciones de cultivo, el crecimiento fue más lento y la densidad óptica final menor con el hidrolizado de paja de trigo que cuando se añadió urea o YNB al cultivo. Esto sugiere que, aunque la glucosa estaba disponible para la fermentación, el hidrolizado no contenía suficientes elementos nutricionales para permitir que el cultivo se dividiera a su tasa máxima y alcanzara una densidad óptima.

Para investigar la causa de la disminución del crecimiento celular en el hidrolizado de paja de trigo, se cultivó S. cerevisiae NCYC 2826 en un hidrolizado elaborado con una concentración de paja inicial del 5%, 10%, 15% y 20% y suplementado con 2,3 mg ml-1 de urea. La figura 1B muestra que, a medida que aumentaba la concentración de paja inicial, la fase de retraso del crecimiento también aumentaba hasta 20 h con una concentración de paja inicial del 20%. La DO final también se incrementó al aumentar la concentración de paja, debido a las mayores concentraciones de glucosa liberada. El aumento de la fase de latencia es característico de la inhibición del crecimiento por los compuestos de furano a menudo presentes en los hidrolizados de paja. El análisis del contenido de furano del hidrolizado mostró que el contenido de HMF era insignificante (datos no mostrados), pero la concentración de furfural presente aumentaba con la concentración inicial de paja, alcanzando 0,5 mg ml-1 al 20% de contenido inicial de paja (Figura 2). Estos datos sugieren que el crecimiento de S. cerevisiae NCYC 2826 en el hidrolizado de paja de trigo está limitado por la concentración de furfural presente en el hidrolizado.

Concentración de glucosa (cuadrados) y furfural (triángulos) presentes en los hidrolizados de paja de trigo elaborados como se describe en la sección ‘ Métodos ‘ con una concentración creciente de paja inicial.

Análisis del crecimiento del conjunto de cepas SGRP sobre el furfural

Con el fin de identificar las cepas de levadura que pueden ser resistentes al furfural contaminante, el conjunto de cepas SGRP descrito en los métodos se cultivó en YNB, 100 mM de glucosa y la presencia de 1,5 mg ml-1 de furfural. La tabla 1 muestra el análisis de la tolerancia de la cepa SGRP a 1,5 mg ml-1 de furfural utilizando el sistema de puntuación descrito en la sección «Métodos». Se necesitó un sistema de puntuación en lugar de los tiempos medios de retardo, ya que las réplicas de la cepa que no crecieron no tenían una fase de retardo medible, pero aún así debían incluirse en el conjunto de datos.

Previamente habíamos observado que el aumento del inóculo en los cultivos que contenían furfural conducía a una disminución de la fase de retardo, presumiblemente al maximizar la cantidad de células de levadura viables introducidas en el medio, lo que conducía a un establecimiento más rápido de la fase exponencial de crecimiento (datos no mostrados). Por lo tanto, para estos experimentos, se utilizó un volumen de inóculo del 5% de cultivo nocturno. Los datos de la Tabla 1 muestran que el crecimiento en las placas de réplica fue extremadamente variable y también dependiente de la cepa, lo que demuestra que una concentración de 1,5 mg ml-1 de furfural es suficiente para distinguir la tolerancia al furfural en las cepas de S. cerevisiae y S. paradoxus. Cuando se probó el crecimiento de las cepas en YNB que contenía 100 mM de glucosa y 2,0 o 3,0 mg ml-1 de furfural, se observó muy poco crecimiento en cualquiera de estas condiciones de cualquiera de las cepas analizadas. Así pues, se decidió seleccionar las cepas utilizando los datos de 1,5 mg ml-1 y someterlas a un examen más detallado del furfural. El análisis de los datos presentados en la Tabla 1 muestra que, en general, las cepas de S. cerevisiae crecieron mejor que las de S. paradoxus con 1,5 mg ml – 1 de furfural. Casi el 20% de las cepas de S. paradoxus ensayadas no obtuvieron la máxima calificación en el sistema de puntuación, mientras que en el caso de S. cerevisiae esta cifra fue inferior al 10%, lo que también se refleja en la mayor puntuación media global de S. cerevisiae, que fue de 2,5 ± 1,4 frente a 2,1 ± 1,4 de S. paradoxus. Sin embargo, dentro de cada grupo de cepas hubo una variación significativa, con puntuaciones que iban de 1,7 a 3,7 para S. cerevisiae y de 0,3 a 3,0 para S. paradoxus. Se consideró que las cepas que obtuvieron una puntuación superior a 2,9 con una desviación estándar inferior a 1,5 mostraban una tolerancia significativa al furfural. Por consiguiente, las cepas de S. cerevisiae NCYC 3284 (ex suelo, EE.UU.), NCYC 3290 (ex vino bili, África occidental), NCYC 3312 (ex suelo, Países Bajos) y NCYC 3451 (ex mosto, Irlanda), junto con S. paradoxus NCYC 3277 (ex corteza de roble, Reino Unido), se examinaron más a fondo en un cribado más detallado del furfural.

Efectos de las concentraciones crecientes de furfural sobre el crecimiento y la producción de etanol

La figura 3 muestra el crecimiento en presencia de cantidades variables de furfural (de 0,1 a 4,0 mg ml-1) para las cepas de S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 y NCYC 3451 y la cepa de S. paradoxus NCYC 3277 identificada en la tabla 1 del conjunto de cepas del SGRP como de mayor resistencia al furfural. Archivo adicional 1: La figura S1 muestra los datos de crecimiento correspondientes representados en una escala logarítmica. También se incluyó la cepa de control S. cerevisiae NCYC 2826 con fines comparativos. Para las seis cepas, a medida que aumentaba la concentración de furfural, las curvas de crecimiento empezaban a mostrar incrementos en la fase de retardo, como se había visto anteriormente en los crecimientos con furfural. Todas las cepas probadas fueron capaces de crecer en YNB suplementado con 100 mM de glucosa y de 0,1 a 1,5 mg ml-1 de furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, nuestra cepa de control, sólo pudo crecer con hasta 1,5 mg ml-1, lo que supuso una reducción del 30% de la DO final en comparación con el crecimiento con 0,1 mg ml-1 de furfural. La tabla 2 muestra que la producción de etanol por NCYC 2826 en estas condiciones se redujo considerablemente en comparación con el rendimiento de aproximadamente el 90% observado cuando se cultivó sólo con YNB y glucosa o con hidrolizado de paja de trigo. S. cerevisiae NCYC 2826 se aisló del mosto de la uva, por lo que es poco probable que haya evolucionado la capacidad de crecer y fermentar durante la exposición al furfural.

En su estudio de genómica de poblaciones, Liti et al. identificaron cinco linajes de S. cerevisiae bien definidos y aislados geográficamente (malayo, norteamericano, saké, africano occidental y «vinícola/europeo»), así como muchas cepas recombinantes diferentes (mosaico) de estos linajes. De los resultados del presente estudio se desprende que la resistencia al furfural no es una característica fenotípica específica de un linaje concreto de S. cerevisiae. De las cuatro cepas SGRP de S. cerevisiae resistentes al furfural identificadas, NCYC 3284 (YPS128) pertenece al linaje norteamericano, NCYC 3290 (DBVPG 6044) al linaje de África occidental, NCYC 3312 (DBVPG 1373) al linaje «vinícola/europeo», mientras que NCYC 3451 (un derivado de una sola espora de NCYC 361) es una cepa recombinante.

S. cerevisiae NCYC 3451 mostró la mayor resistencia al furfural (Figura 3F, Archivo adicional 1: Figura S1F) y fue capaz de crecer en presencia de hasta 3,0 mg ml-1 de furfural. Además, la producción de etanol en esta cepa no pareció ser inhibida por el furfural, y el mayor rendimiento de etanol (95 ± 15%; Tabla 2) se alcanzó a una concentración (de furfural) de 3,0 mg ml-1. Como ya se ha mencionado, NCYC 3451 es una cepa recombinante y se ha demostrado que tiene un genoma en forma de mosaico derivado de al menos tres linajes diferentes, a saber, Saké, West African y «Wine/European» (Liti et al. ). Aunque se ha registrado como aislada del mosto como levadura de deterioro de la cerveza, la estructura altamente compleja del genoma de esta cepa sugiere fuertemente, aunque no se ha probado, que es de origen industrial (por ejemplo, una cepa de panadería o cervecera). Entre las cuatro cepas restantes de SGRP analizadas, las cepas de S. cerevisiae NCYC 3290 y NCYC 3312 fueron capaces de crecer con 2,5 mg ml-1 de furfural (Figura 3D,C, Archivo adicional 1: Figura S1D y S1C, respectivamente), mientras que S. cerevisiae NCYC 3284 (Figura 3E, Archivo adicional 1: Figura S1E) y S. paradoxus NCYC 3277 (Figura 3B, Archivo adicional 1: Figura S1B) sólo pudieron crecer con 2,0 mg ml-1 de furfural. En general, la producción de etanol en las cinco cepas de SGRP no se vio significativamente afectada por la presencia de furfural. De hecho, en el caso de NCYC 3312, la presencia de 0,5 mg ml-1 de furfural condujo a un notable aumento del rendimiento de etanol, que pasó del 41 ± 8% esperado al 75 ± 5% (Tabla 2). Esto también se observó en la cepa de deterioro de la cerveza NCYC 3451, pero en menor medida (sólo un aumento del 14% en el rendimiento; Tabla 2). De hecho, recientemente se ha demostrado que pequeñas cantidades de alcohol furfurílico, un producto de la deshidratación del furfural en la levadura, pueden conducir realmente a un aumento de la producción de etanol.