Hipersecreción de moco y enfermedades respiratorias crónicas
La hipersecreción de moco en las vías respiratorias contribuye de forma importante a la morbilidad y la mortalidad en muchos pacientes con enfermedades pulmonares crónicas graves, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el asma y la fibrosis quística.35 El exceso de mucosidad en las vías respiratorias puede limitar el flujo de aire; y su presencia es un factor de riesgo particular para aquellos pacientes con EPOC que son propensos a las infecciones torácicas. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica grave de las vías respiratorias que comprende tres afecciones, a saber, la bronquitis crónica (hipersecreción de moco en las vías respiratorias de larga duración), la enfermedad de las vías aéreas pequeñas y el enfisema.36 Su prevalencia y su carga económica están aumentando en todo el mundo.37,38 En la EPOC, los pacientes con hipersecreción crónica de moco tienen un riesgo significativamente mayor de hospitalización y muerte en comparación con los pacientes sin un componente bronquítico marcado.39,40 Los tratamientos actuales para la EPOC son paliativos y no detienen la progresión de la enfermedad,41 y no existe ningún tratamiento específico para la hipersecreción de moco.42 A falta de un tratamiento eficaz para cualquier aspecto de la fisiopatología de la EPOC, se justifica el desarrollo de tratamientos para la hipersecreción de moco. La capacidad de eliminar el moco de los pulmones, mediante el movimiento de los cilios de las vías respiratorias, depende de su viscosidad y elasticidad. Estas propiedades están determinadas por la proporción de glicoproteínas de mucina, en peso, que contiene el moco.43 MUC5AC y MUC5B son las principales mucinas en las secreciones de las vías respiratorias humanas, tanto normales como patológicas.44 En los pacientes con EPOC, los niveles de las mucinas MUC5AC y MUC5B están aumentados en el moco respiratorio, aunque proporcionalmente se secreta más MUC5B.45 Las mucinas son secretadas en las vías respiratorias por las células caliciformes del epitelio y las glándulas seromucosas de la submucosa.43 Una posibilidad para inhibir la secreción de moco es utilizar la actividad inhibidora de las endopeptidasas de la neurotoxina clostridial sobre la fusión de vesículas, dirigida a las células secretoras de mucina de las vías respiratorias utilizando un ligando de orientación adecuado.
Para investigar si una endopeptidasa clostridial adecuadamente dirigida escindiría las proteínas SNARE en las células epiteliales respiratorias humanas y, por tanto, inhibiría la secreción de moco, se generó una proteína de fusión a partir de un gen recombinante que codificaba el dominio LHN de BoNT/C y EGF, designado EGF-LHN/C, para dirigirse a los receptores de EGF en las células secretoras de mucina.34 Se seleccionó el EGF como ligando prototipo para la creación de dicha proteína de fusión porque los receptores del EGF están presentes en las células epiteliales respiratorias humanas46,47 y están regulados al alza en el epitelio de las vías respiratorias de los pacientes con asma y EPOC,48 así como de los fumadores.49 La proteína de fusión recombinante EGF-LHN/C escinde la proteína SNARE relevante sintaxina en una línea celular metastásica mucoepidermoide humana, las células H292, in vitro de forma dependiente de la concentración.34 El pretratamiento de las células H292 con EGF-LHN/C inhibe la liberación estimulada de mucina en respuesta a un estímulo combinado de EGF y factor de necrosis tumoral-α (TNFα) de forma dependiente de la concentración, con un IC50 de aproximadamente 0,4 nM (Fig. 28-1). Esto se compara muy bien con el efecto inhibitorio del EGF-LHN/C previamente reportado sobre la liberación estimulada de mucina de otra línea celular epitelial respiratoria, la línea celular alveolar humana tipo II A549, en respuesta al mismo estímulo.34 En ambos tipos celulares, no hubo un efecto detectable del EGF-LHN/C sobre el nivel basal de secreción de mucina. La inhibición de la secreción de mucina por parte del EGF-LHN/C se debe a la entrega selectiva de su actividad endopeptidasa a través del receptor del EGF, y no es el resultado de la citotoxicidad de la célula o del antagonismo o la regulación a la baja del receptor.34 El EGF-LHN/C también es capaz de inhibir la liberación estimulada de mucina de las células A549 en respuesta a un cóctel estimulante de citoquinas, una combinación de 1 ng/mL de interferón (IFN)-γ, TNFα e interleucina (IL)-1β, denominada cytomix (Fig. 28-2). Así, el efecto del EGF-LHN/C sobre la liberación estimulada de mucina de las células epiteliales respiratorias es independiente de la naturaleza precisa del estímulo utilizado. El examen histológico muestra que la mucina queda retenida dentro de las células tratadas (Fig. 28-3). Las células de control contienen mucina intracelular teñida, mientras que las células estimuladas muestran una tinción notablemente reducida, lo que indica la secreción de mucina. Las células estimuladas pretratadas con EGF-LHN/C muestran una tinción intracelular retenida, indicando la inhibición de la secreción por EGF-LHN/C. Para evaluar la respuesta de las células a dicha retención intracelular de mucina, se midió el efecto del pretratamiento con EGF-LHN/C en los niveles de ARNm de MUC5AC como indicador de la síntesis de mucina. El pretratamiento con EGF-LHN/C se asocia con una inhibición dependiente de la concentración de la expresión de ARNm de MUC5AC inducida por EGF-TNFα, con un valor IC50 de ∼0,1 nM (Fig. 28-4). Al igual que con la inhibición de la liberación estimulada de mucina de las células, este efecto del EGF-LHN/C se debe a la entrega dirigida de su actividad endopeptidasa a través del receptor del EGF, porque ni un LHN/C que carece de un ligando del EGF para dirigirlo al receptor del EGF ni una forma mutada de la proteína de fusión en la que el dominio endopeptidasa ha sido inactivado por tres cambios de residuos en la región catalítica (EGF-TE-LHN/C) inhiben la expresión del ARNm de MUC5AC. Este efecto de EGF-LHN/C sobre la expresión de ARNm de MUC5AC sugiere la existencia de un posible mecanismo de retroalimentación negativa entre la liberación de mucina y la síntesis de mucina en las células epiteliales respiratorias, y también que la expresión del gen se regula a la baja en respuesta a la inhibición de la secreción por una endopeptidasa clostridial recombinante.
Las proteínas de fusión de endopeptidasas clostridiales recombinantes que pueden inhibir la secreción de moco, como la ejemplificada por EGF-LHN/C, tienen el potencial de desarrollarse como proteínas terapéuticas para el tratamiento de la EPOC, la bronquitis crónica, la fibrosis quística y otras afecciones respiratorias crónicas que implican una producción excesiva de moco en las vías respiratorias. La longevidad de la actividad de la proteína significaría que el producto sólo necesitaría ser inhalado con poca frecuencia, lo que lo haría muy adecuado para el tratamiento de enfermedades respiratorias crónicas de este tipo.