Este estudio evaluó la orientación sexual y los índices de estrés psicobiológico en relación con las hormonas sexuales salivales como parte de un paradigma de estrés bien validado en el laboratorio. Los participantes fueron 87 adultos sanos de una media de 25 años que se autoidentificaron como mujeres lesbianas/bisexuales (n = 20), mujeres heterosexuales (n = 21), hombres gay/bisexuales (n = 26) y hombres heterosexuales (n = 20). Se recogieron dos muestras de saliva quince minutos antes y quince minutos después de la exposición a una prueba de estrés social de Trier modificada para determinar las concentraciones de testosterona, estradiol y progesterona mediante un ensayo enzimático. La media de las hormonas sexuales se analizó además en asociación con los índices de estrés relacionados con la producción sistémica de cortisol (área bajo la curva con respecto al suelo) basada en diez medidas a lo largo de la visita de dos horas, la carga alostática indexada mediante 21 biomarcadores y el estrés percibido evaluado mediante un cuestionario bien validado. Los resultados revelaron que las mujeres lesbianas/bisexuales tenían concentraciones generales de testosterona y progesterona más elevadas que las mujeres heterosexuales, mientras que no se encontraron diferencias entre los hombres homosexuales/bisexuales en comparación con los hombres heterosexuales. Las mujeres lesbianas/bisexuales y los hombres heterosexuales mostraron asociaciones positivas entre las concentraciones medias de estradiol y la carga alostática, mientras que los hombres gay/bisexuales y las mujeres heterosexuales mostraron asociaciones positivas entre la testosterona media y la producción sistémica de cortisol. En resumen, las variaciones de las hormonas sexuales parecen variar según la orientación sexual entre las mujeres, pero también en función de la producción sistémica de cortisol, la carga alostática y el estrés percibido para ambos sexos.