Cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC): dos métodos de cromatografía líquida en comparación directa. En este artículo se analizan las diferencias entre ambas técnicas, haciendo especial hincapié en los requisitos de sus respectivos analitos.
Los nombres de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ofrecen una pista sobre las diferencias entre estos métodos cromatográficos. Mientras que la HPLC trabaja con alta presión para analizar pequeños compuestos químicos, la FPLC purifica grandes biomoléculas como las proteínas o el ADN. La cromatografía de biomoléculas es muy exigente y sensible porque no pueden soportar altas temperaturas, altas presiones o los disolventes que se suelen utilizar en la HPLC. Por estas razones, la separación de biomoléculas requiere un enfoque alternativo a la HPLC.
Se suelen utilizar varios términos para referirse a la cromatografía líquida rápida de proteínas, como biocromatografía, bioseparación o biopurificación. Esta forma especial de cromatografía se aplica para purificar grandes biomoléculas de varios kilodaltons (kDa) como proteínas, nucleótidos o péptidos (Figura 1). El objetivo del usuario de la FPLC es obtener un producto lo más puro y nativo posible. Los objetivos de la HPLC clásica, por otro lado, son identificar y calificar analitos, generalmente compuestos pequeños que varían en tamaño desde unos pocos átomos hasta aproximadamente 3000 Da.
El reto de obtener una proteína pura a partir de un extracto celular
Típicamente, las biomoléculas se purifican a partir de células bacterianas o eucariotas, que están repletas de proteínas, ADN, ARN y membranas celulares. Por lo tanto, la purificación de la proteína de interés a partir de un extracto celular puede ser muy difícil. Los bioquímicos aplican varios trucos: uno es utilizar proteínas recombinantes, que son sobreexpresadas por las células. La sobreexpresión de la proteína de interés permite la purificación en mayores cantidades. El segundo truco consiste en añadir una etiqueta a la proteína de interés, que es reconocida específicamente por la resina (material de la columna). Las proteínas sin etiqueta no se unen a la columna y eluyen inmediatamente, mientras que la proteína deseada se enriquece y puede separarse fácilmente.
Las biomoléculas se purifican a partir de lisados celulares, lo que significa volúmenes de muestra mucho mayores que en la HPLC analítica. Por lo tanto, se utilizan bucles de muestra más grandes o incluso bombas con caudales más altos para inyectar la muestra. Además, los materiales de las columnas de FPLC y HPLC difieren completamente. Para la HPLC, se aplican perlas de sílice con tamaños de partícula muy pequeños y con una gran resistencia a las altas presiones, mientras que la FPLC requiere material de agarosa o polímero con tamaños de partícula más grandes para la mayoría de los métodos. Las resinas utilizadas para la FPLC no son tan estables a la presión como las perlas de sílice y son muy sensibles a las burbujas de aire. Además, no sólo difiere el material de la columna, sino también el hardware de la misma. En la HPLC clásica se utilizan columnas de acero inoxidable resistentes a la presión. Como ya se ha mencionado, la estabilidad de la presión no es importante para la FPLC, por lo que es posible trabajar con columnas de vidrio transparentes y biocompatibles. Esto supone una gran ventaja, ya que el usuario puede comprobar si la columna presenta burbujas de aire o supervisar el estado del material durante una ejecución de purificación.
Biomoléculas diversas, métodos de purificación diversos
Las diferencias en el material de la columna también se reflejan en los métodos. En la HPLC analítica, la cromatografía de fase inversa con fases estacionarias hidrofóbicas y fases móviles polares es el método de elección, mientras que en la FPLC se aplica una mayor variedad de métodos (Figura 2). Un método de FPLC es la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), en la que las moléculas se separan según su tamaño. Las moléculas más pequeñas pueden difundirse en los poros de las perlas, mientras que las moléculas más grandes pasan por la columna casi sin ser retenidas. Las moléculas más pequeñas eluyen más tarde de la columna generando un gradiente de estas moléculas según su tamaño. Otro método de separación es la cromatografía de intercambio iónico. Las biomoléculas se separan y purifican según su carga específica, que depende del pH del tampón. Cuanto más cargada esté la proteína, mejor se unirá a la resina de carga opuesta. Para eluir la proteína de la columna, se aumenta la concentración de iones de sal durante el proceso. Los iones salinos compiten con la proteína para unirse a la resina. Otro método importante de FPLC es la cromatografía de afinidad, en la que la molécula de interés puede unirse específicamente a la columna, mientras que las otras moléculas no pueden y eluirán sin unirse. Aquí se utilizan columnas con medios especiales que reconocen la biomolécula deseada. Una forma especial de cromatografía de afinidad es la afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). La proteína de interés tiene que ser alterada genéticamente mediante la adición de una etiqueta a la proteína, que suele consistir en seis histidinas. La resina IMAC reconoce específicamente este «Hisâtag». La elución tiene lugar aumentando la concentración de imidazol que compite con las proteínas marcadas con His. Además, las proteínas también pueden separarse por su hidrofobicidad específica utilizando el método de separación por interacción hidrofóbica. La resina se compone de tal manera que las proteínas más hidrofóbicas se unirán con más fuerza a la columna y se eluirán disminuyendo el gradiente de sal.
Para purificar una proteína deseada, se suele utilizar una combinación de métodos. En el primer paso, el llamado paso de «captura», la proteína se purifica a partir del extracto crudo. Normalmente, se utiliza la cromatografía de afinidad para este primer paso de la purificación. El segundo paso, el paso «intermedio», elimina la contaminación adicional mediante cromatografía de intercambio iónico o interacción hidrofóbica. El objetivo de la etapa final de «pulido» -generalmente una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño- es deshacerse de todas las impurezas restantes para obtener un producto de alta pureza. Esta estrategia de purificación de proteínas depende totalmente de la biomolécula específica. En algunos casos, una purificación en dos pasos puede ser suficiente. Cuantos más métodos se combinen, más cantidad de la proteína de interés se pierde durante la purificación, pero se puede conseguir una mayor pureza.
Después de la purificación, la muestra obtenida puede analizarse para determinar la pureza, la concentración y la función o la actividad de la enzima mediante HPLC, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), ensayos de actividad enzimática o espectrometría de masas.
Requisitos de la FPLC
Las proteínas están compuestas por aminoácidos alineados como una cadena. Esta cadena se pliega en una estructura tridimensional, que es la clave de la función y la actividad de cada proteína. Por lo tanto, es muy importante mantener esta estructura proteica durante el proceso de purificación. Los factores externos como la alta temperatura, la alta presión, el pH extremo o los disolventes pueden alterar la estructura de la proteína y, por tanto, se evitan en la FPLC. La temperatura de trabajo para las proteínas suele ser de 4 °C. Por ello, una máquina de FPLC suele colocarse dentro de una cámara o sala fría donde está expuesta no sólo a bajas temperaturas sino también a la humedad de condensación. Los componentes de un sistema FPLC tienen que estar especialmente diseñados para estas condiciones. Además, los componentes de la FPLC se enfrentan a un reto adicional, a saber, las soluciones tampón salinas que se utilizan como eluyentes. Por lo general, se elige un pH isosmótico y concentraciones de sal similares a las del entorno celular. Los sistemas de cromatografía suelen ser de acero inoxidable. Por un lado, la sal de los tampones puede provocar corrosión y, por otro, los iones metálicos del acero inoxidable pueden interferir con la proteína y alterar su estructura. Por lo tanto, es importante evitar el acero inoxidable y utilizar materiales biocompatibles como la cerámica de poliéter-éter-cetona (PEEK) o el titanio al realizar la FPLC. Al igual que los sistemas HPLC, los sistemas FPLC también se controlan mediante software. Hay diferencias considerables entre el software de FPLC y el de HPLC. Este último se utiliza principalmente para analizar las muestras y contiene muchas herramientas analíticas. En cambio, en la FPLC no se necesitan muchas herramientas analíticas y es habitual generar métodos basados en el volumen o incluso en el volumen de la columna (Figura 3). Para la mayoría de las aplicaciones de FPLC, se prefieren los métodos basados en el volumen de la columna, lo que facilita su ampliación. El software de FPLC es, en su mayoría, muy intuitivo y fácil de usar, e incluye un control directo que permite ajustar los parámetros durante una ejecución. De este modo, el usuario puede reaccionar ante diferentes situaciones de forma muy espontánea.
Por lo tanto, está claro que existen grandes diferencias entre estas dos áreas cromatográficas (Tabla 1). Los métodos, el hardware y el software difieren enormemente según se analice o purifique la molécula. En el caso de las aplicaciones FPLC, la naturaleza sensible de las muestras y la ambición de mantenerlas lo más nativas posible se suman al desafío. En general, ambas técnicas son áreas muy interesantes que todos los que trabajan en este campo deberían conocer.
Stephanie Runde se graduó en la Universidad Técnica de Múnich, Alemania, con un diploma en bioquímica. Obtuvo su doctorado en la Freie Universität de Berlín, Alemania, y actualmente trabaja en Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH como directora de producto para FPLC.