TEXT

Yersinia pestis on ruton etiologinen aiheuttaja, ja sitä voidaan käyttää biologisena aseena (1, 13, 17-20, 23). Tämän vuoksi on tärkeää, että kehittyvä lääkeresistenssi, olipa se sitten luonnollista tai keinotekoista, olisi voitava havaita käyttämällä standardoituja menetelmiä, jotka on helppo toteuttaa useissa laboratorioissa. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kuvailee Y. pestis -bakteerin mikrobilääkeherkkyyden testaamiseen tarkoitetun referenssiliemi-mikrobiluutiomenetelmän (BMD) ja antaa MIC-tulkintaohjeet kahdeksalle mikrobilääkkeelle (6). BMD-menetelmässä käytetään kationisäädettyä Mueller-Hinton-lientä (CAMHB), ja sitä on inkuboitava 35 °C:ssa 24 tuntia, ja sitä voidaan inkuboida myös 48 tuntia, jos 24 tunnin kasvu ei riitä loppupisteen tulkintaan. Valitettavasti viite-BMD:tä on vaikea ottaa käyttöön monissa laboratorioissa, koska se on suhteellisen kallista ja työlästä ja edellyttää paneelien säilyttämistä pakastettuna tai dehydratoituna. On olemassa useita vaihtoehtoisia herkkyystestausmenetelmiä, kuten levydiffuusio- ja Etest-menetelmät. Ennen kuin näitä menetelmiä voidaan kuitenkin käyttää johonkin lajiin, ne on arvioitava ja niitä on verrattava BMD:hen, jotta voidaan määrittää menetelmien vertailussa saatujen tulosten väliset korrelaatiot.

Y. pestis -isolaatit ovat vaativia ja saattavat kasvaa hitaammin keinotekoisilla elatusaineilla kuin muut yleiset Enterobacteriaceae-lajit, minkä vuoksi Y. pestis -lajin herkkyystestausmenetelmiä on ollut vaikea standardoida. Kirjallisuudessa on kuvattu useita menetelmiä. Levydiffuusiotestaus on yleensä tehty Mueller-Hinton-agarilla (MHA) tyypillisesti 48 tunnin inkubaatiolla 35 °C:n lämpötilassa, mutta menetelmäkuvaukset ovat joskus puutteellisia (10, 16, 24). Wong et al. (25) käyttivät Etest-menetelmää käyttäen MHA:ta, jossa oli 5 % lampaanverta, inkubointia 35 °C:ssa ja inokulaatiota, joka vastasi nro. 1 McFarlandin standardia useimmissa levy- tai Etest-diffuusiotutkimuksissa käytetyn 0,5 McFarlandin standardin sijasta. Agar-laimennus, jossa käytetään MHA:ta, jota inkuboidaan 27-30 °C:ssa 48 tuntia, on yleisin kirjallisuudessa raportoitu menetelmä (7, 8, 11, 12, 22). Myös liemimakrodiluutio- ja mikrodiluutiomenetelmiä on käytetty eri inkubaatiolämpötiloissa (2, 21).

Kiekkodiffuusio- ja Etest-menetelmillä on useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä houkuttelevia vaihtoehtoisia menetelmiä herkkyystesteissä, kuten levykkeiden ja liuskojen helppo varastointi ja pitkä säilyvyysaika. Lisäksi nämä ovat agariin perustuvia menetelmiä, ja loppupisteet voivat olla helpommin luettavissa kuin BMD:n menetelmät. Etestin lisäetuna on MIC-tuloksen tuottaminen. Tässä raportissa esitellään tulokset monikeskustutkimuksesta, jossa verrattiin Etest- ja levydiffuusiomenetelmiä CLSI:n BMD-referenssimenetelmään Y. pestis -bakteerin herkkyystestauksessa.

(Tämä raportti esiteltiin osittain American Society for Microbiologyn 107. yleiskokouksessa Torontossa Kanadassa 21.-25. toukokuuta 2007).)

Kaksikymmentäkuusi erilaista Y. pestis -kantaa, jotka olivat peräisin CDC:n (Centers for Disease Control and Prevention) ja USAMRIID:n (U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases) kokoelmista, testattiin sekä Etest- että BMD-menetelmällä neljässä testauspaikassa ja lisäksi levydiffuusion avulla kahdessa näistä paikoista. Kuusi kantaa oli biovar Antiqua, seitsemän biovar Medievalis ja 12 biovar Orientalis; yhtä epätyypillistä isolaattia ei voitu luokitella mihinkään biovariin. Mikrobilääkkeet testattiin sekä BMD:llä että Etestillä (bioMérieux, Durham, NC), ja niiden vastaavat vaihteluvälit olivat BMD:llä ja Etestillä seuraavat: kloramfenikoli 0,03-64 μg/ml ja 0,016-256 μg/ml; siprofloksasiini 0,03-64 μg/ml ja 0,002-32 μg/ml; doksisykliini 0,03-64 μg/ml ja 0,016-256 μg/ml.016-256 μg/ml; gentamysiinille 0,03-64 μg/ml ja 0,016-256 μg/ml; levofloksasiinille 0,06-64 μg/ml ja 0,002-32 μg/ml; streptomysiinille 0,03-64 μg/ml ja 0,002-32 μg/ml; streptomysiinille 0,03-64 μg/ml ja 0.016-256 μg/ml; tetrasykliinin osalta 0,03-64 μg/ml ja 0,016-256 μg/ml; ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin osalta 0,015/32-16/304 μg/ml ja 0,002/0,038-32/608 μg/ml. Koska joidenkin lääkkeiden BMD-testausalueet eivät kattaneet Etestillä saatavia alhaisempia pitoisuuksia, menetelmien välistä olennaista yhdenmukaisuutta (± 1 log2-laimennos) pidettiin joidenkin tulosvertailujen osalta epätarkoituksenmukaisena (esim. BMD:n levofloksasiinin MIC-arvo oli ≤0,06 μg/ml ja Etestin MIC-arvo oli 0,03 μg/ml). CDC:ssä valmistettiin 96 kuopan MIC-tarjottimet käyttäen 100 μl CAMHB:tä (BBL, Sparks, MD) kuoppaa kohti; tarjottimet säilytettiin jäädytettyinä -70 °C:ssa ja lähetettiin osallistuviin laboratorioihin. Testit suoritettiin CLSI:n standardimenetelmillä BMD:lle ja levydiffuusiolle (4-6). Inokulaatiot valmistettiin 18-24 tunnin aerobisista viljelmistä, joita kasvatettiin 5-prosenttisella lampaanveriagarilevyllä (BBL) suoralla pesäkesuspensiomenetelmällä Mueller-Hinton-liemessä (MHB) (Remel, Lenexa, KS) siten, että ne vastasivat 0,5 McFarlandin sameusstandardia (4); samoja inokulaatioita käytettiin halkaisijaltaan 150 mm:n MHA-levyjen inokulaatioon Etest- ja kiekkodiffuusiotesteissä. Välittömästi inokulaation jälkeen suoritettiin vähintään kaksi satunnaista pesäkelaskentaa kussakin testauspaikassa positiivisen BMD-kasvun kontrollikuopan kanssa inokulaation koon arvioimiseksi. Levylle levitettiin enintään neljä Etest-liuskaa. Levydiffuusiota varten käytettiin kaupallisia levyjä (BBL), jotka levitettiin itsepuristuvalla monilevydispenserillä (BBL). BMD-levyjä ja MHA-levyjä sekä Etest- että levydiffuusiota varten inkuboitiin 35 °C:ssa ja luettiin 24 ja 48 tunnin jaksoissa. Etestit luettiin Etest-pakkausselosteen ohjeiden mukaisesti seuraavasti: kloramfenikoli, doksisykliini, tetrasykliini ja trimetopriimi-sulfametoksatsoli luettiin 80 %:n estossa leikkauspisteessä; siprofloksasiini, levofloksasiini, gentamisiini ja streptomysiini luettiin 100 %:n estossa. Tietoanalyysejä varten Etest MIC-arvot pyöristettiin ylöspäin lähimpään log2-laimennokseen. Escherichia coli ATCC 25922 ja Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 käytettiin BMD:n ja Etestin laadunvalvontaan. Laadunvalvontakantojen MIC-arvot määritettiin inkuboimalla 16-20 tuntia. Streptomysiinin hyväksyttävät BMD-laadunvalvonta-alueet on vahvistettu aiemmin CDC:ssä (julkaisemattomat tiedot). Kloramfenikolin Etestin laadunvalvonta suoritettiin testaamalla Escherichia coli ATCC 25922 ja soveltamalla CLSI:n BMD:n hyväksyttävää vaihteluväliä.

Etestin ja BMD:n tulosten välisen yhdenmukaisuuden mittaamiseksi tutkittiin log2-laimennoksen MIC-arvojen erojen jakaumaa ja laskettiin kullekin lääkeaineelle niiden MIC-määritysten prosentuaalinen osuus, jotka antoivat identtiset arvot (olennainen yhdenmukaisuus vertailumenetelmän tarkkuusrajoissa ). Sen selvittämiseksi, tuottiko Etest-menetelmä merkittävästi alhaisemmat tai korkeammat MIC-arvot kuin vertailumenetelmä, suoritimme myös Wilcoxonin allekirjoitetun järjestyksen testin näiden kahden testin log2-laimennoksen MIC-arvoille käyttäen SAS-tilasto-ohjelmistoa (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC-arvoja, jotka olivat ± 1 log2-laimennoksen sisällä, pidettiin identtisinä tämän testin osalta. Tulkintaluokkien (herkkä, keskivaikea ja resistentti) tulosten vertailu tehtiin laskemalla pienten, suurten ja erittäin suurten virheiden osuudet.

Yleisesti MIC-loppupisteet olivat helpommin havaittavissa BMD:llä kuin Etestillä 24 tunnin kohdalla (tietoja ei ole esitetty). Kolmessa testipaikassa (A, B ja C) lähes kaikki BMD:n ja Etestin MIC-arvot olivat luettavissa 24 tunnin inkubaation jälkeen; poikkeuksena oli yksi Etestin tulos. Tutkimuspaikalla D BMD:n MIC-arvot olivat luettavissa 24 tunnin kuluttua kaikille paitsi yhdelle kannalle. Kasvu oli riittämätöntä 24 tunnin Etestin MIC-arvojen saamiseksi kahdeksalle kannalle paikassa D. Etestin MIC-arvot, joita ei voitu lukea 24 tunnin kasvun riittämättömyyden vuoksi, olivat lääkkeittäin seuraavat: kloramfenikoli n = 6, siprofloksasiini n = 4, doksisykliini n = 3, gentamisiini n = 2, levofloksasiini n = 5, streptomysiini n = 5, tetrasykliini n = 4 ja trimetopriimi-sulfametoksatsoli n = 4. Kaikki testauspaikat pystyivät lukemaan kaikki tulokset 48 tunnin kuluttua, joten vertailussa käytettiin 48 tunnin tuloksia. Pesäkeluvut osoittivat, että BMD-kuoppien inokulaatiotiheydet olivat hyväksyttävissä rajoissa kaikissa neljässä testipaikassa; paikkojen keskiarvot vaihtelivat 1,1 × 105 CFU/ml:stä 4,2 × 105 CFU/ml:iin.

Kunkin mikrobilääkkeen MIC90-arvoa ja MIC-aluetta verrattiin menetelmäkohtaisesti (taulukko 1). Kloramfenikolia lukuun ottamatta kaikkien lääkkeiden MIC90-arvot olivat kaikilla menetelmillä samat tai ± 1 log2-laimennoksen sisällä toisistaan. Etest- ja BMD-menetelmien välinen kategoriayhteensopivuus oli kaikkien lääkkeiden osalta erinomainen, 97-100 prosenttia; kaikki virheet olivat vähäisiä (taulukko 1). Kaikki BMD:n ja Etestin MIC-arvot olivat 24 tunnin inkubaation jälkeen herkällä alueella (tietoja ei ole esitetty). Useimmat MIC-arvot olivat 48 tunnin kuluttua herkkyysalueella lukuun ottamatta seuraavia ei-herkkiä tuloksia: kloramfenikoli (n = 2), siprofloksasiini (n = 1) ja streptomysiini (n = 5). Suurin osa ei-herkistä tuloksista saatiin BMD-menetelmällä eikä Etest-menetelmällä (kuva 1).

Kahta menetelmää verrataan parhaiten analysoimalla olennaista yhteneväisyyttä (MIC-arvojen prosenttiosuudet, jotka ovat ± 1 log2-laimennoksen sisällä kahdella menetelmällä ). Olennainen yksimielisyys kaikkien kohteiden osalta yhteensä (mukaan lukien asteikon ulkopuoliset MIC-arvot) oli ≥ 90 % siprofloksasiinin, doksisykliinin, levofloksasiinin, streptomysiinin ja tetrasykliinin osalta. Gentamysiinin, trimetopriimi-sulfametoksatsolin ja kloramfenikolin olennaisen yhteisymmärryksen arvot olivat alhaisemmat (88 %, 78 % ja 35 %). Kloramfenikolia ja trimetopriimi-sulfametoksatsolia lukuun ottamatta olennainen yksimielisyys kunkin lääkkeen osalta vaihteli yleensä vähän tai ei lainkaan eri paikkojen välillä (taulukko 3). Kloramfenikolin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin osalta MIC-menetelmien välinen olennainen yksimielisyys yksittäisissä toimipaikoissa vaihteli 4 %:sta 81 %:iin ja 58 %:sta 96 %:iin.

Gentamysiinin ja doksisykliinin Etestin MIC-arvot olivat merkitsevästi (P = 0.03) korkeammat kuin vastaavat BMD:n MIC-arvot (taulukko 2); menetelmien välisen olennaisen yhteneväisyyden arvot olivat kuitenkin edelleen hyvät, 88 % ja 93 %, kunkin lääkkeen osalta (taulukko 2). Kloramfenikolin, siprofloksasiinin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin Etestin MIC-arvot olivat keskimäärin merkitsevästi (P < 0,001) alhaisemmat kuin vastaavat BMD:n MIC-arvot, ja vain siprofloksasiinin olennainen yhdenmukaisuus oli ≥90 %. Levofloksasiinin, streptomysiinin ja tetrasykliinin osalta Etestin ja BMD:n MIC-arvojen välillä ei havaittu tilastollisia eroja.

Levydiffuusiossa kaikki mikrobilääkekiekot streptomysiinikiekkoja lukuun ottamatta tuottivat halkaisijaltaan suuria vyöhykkeitä; joidenkin vyöhykkeiden halkaisija ylitti 40-50 mm:n rajan (taulukko 4), ja ne menivät päällekkäin toistensa kanssa MHA-levyllä. Näitä suuria vyöhykkeitä tuottavien lääkkeiden vyöhykerajat olivat usein epäselviä tai epämääräisiä. Kloramfenikoli- ja trimetopriimi-sulfametoksatsolilevyt tuottivat toisinaan kaksoisvyöhykeilmiön, jossa kasvun sisempi marginaali oli vaaleampi, mikä johtui mahdollisesti lääkkeen staattisesta aktiivisuudesta tämän hitaasti kasvavan organismin kanssa. Streptomysiinikiekot tuottivat pienimmän (halkaisijaltaan 23-24 mm) keskimääräisen estovyöhykkeen koon ja selkeimmät, luettavissa olevat vyöhykkeet. Muiden levytyyppien vyöhykekoot olivat keskimäärin 30-42 mm halkaisijaltaan 48 tunnin kohdalla, ja niiden halkaisijat olivat vaikeammin luettavissa.

Yleisesti Etest-menetelmän ja mikrobilääkeherkkyysmäärityksessä käytettävän BMD-vertailumenetelmän välillä oli hyvä olennainen yhdenmukaisuus. Kloramfenikolin, gentamysiinin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin osalta Etestin ja BMD:n väliset olennaiset yhteisymmärrysprosentit olivat kuitenkin alhaisemmat kuin 90 %:n vähimmäissuositukset, joita Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) suosittelee uuden menetelmän käyttämiseksi kliinisessä testauksessa (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Valaistuksen voimakkuuden erot biologisessa suojakaapissa kussakin testauspaikassa voivat vaikuttaa osaltaan päätepisteen määrittämiseen. Olemme havainneet, että Etestin päätepisteen lukeminen on helpompaa, kun kaappiin on sijoitettu lukulamppu täydentämään valonlähdettä. Kaikki toimipaikat toimipaikkaa D lukuun ottamatta käyttivät tätä ylimääräistä valonlähdettä herkkyystestien luettavuuden parantamiseksi. Tetrasykliinin ja doksisykliinin Etestit, kuten kloramfenikolin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin Etestit, luettiin myös 80 %:n päätepisteellä, mutta kaksinkertaisia ellipsejä ei ollut havaittavissa ja olennainen yksimielisyys oli ≥ 90 % molempien tetrasykliiniluokan lääkkeiden osalta, joten näyttää siltä, että tämä Etest-ilmiö vaihtelee Y. pestis -bakteerin osalta lääkeryhmittäin.

Gentamysiinin olennainen yksimielisyys oli kaiken kaikkiaan 88 %:n luokkaa, mikä on juuri ja juuri alle 90 %:n suositellun yksimielisyysrajan. Kahdessa paikassa oli korkea (96 %) olennainen yksimielisyys, mutta kahdessa muussa paikassa yksimielisyys oli alhaisempi (77 % ja 81 %). Syytä tähän vaihteluun ei tiedetä. Etestin ja BMD:n MIC-arvojen yleiset MIC-jakaumat ovat kuitenkin samanlaiset (kuva 1). On ehdotettu, että uusissa herkkyysmenetelmissä, jotka tehdään hitaasti kasvavilla tai vaativilla organismeilla, testejä ei pitäisi pitää yhtä tiukasti kiinni tästä standardista ja että alhaisempi olennainen yksimielisyys on sallittua (14). Tämä logiikka vaikuttaa sopivalta gentamysiini-testin osalta, koska olennainen yksimielisyys oli 88 prosenttia. Trimetopriimi-sulfametoksatsoli-testin hyväksyttävyys 78 prosentin välttämättömän yhdenmukaisuuden osalta on epäselvä.

Tämän tutkimuksen rajoituksena oli se, että mukaan ei otettu isolaatteja, joiden resistenssi oli tunnettu. Madagaskarin lääkeresistenttien kantojen (3, 9-11) saatavuus on rajoitettu. Muut raportit Y. pestis -bakteerin lääkeresistenssistä ovat harvinaisia, eivätkä resistentit kannat ole hyvin karakterisoituja (15, 16, 24). Siksi emme voineet arvioida Etest-menetelmän kykyä havaita tunnettua resistenssiä Y. pestis -bakteerissa.

Kiekkodiffuusiomenetelmää ei suositella Y. pestis -bakteerille, koska useimpien testattujen lääkeaineiden huonosti määriteltyjen inhibitiovyöhykkeiden ja suurten vyöhykkeiden halkaisijoiden lukeminen on vaikeaa. Streptomysiinikiekkotestaus voi olla perusteltua tutkia tarkemmin, jos streptomysiinille resistenttejä isolaatteja tulee saataville, koska vyöhykekoot olivat pienempiä ja selvempiä kuin muilla kiekoilla saadut vyöhykekoot.

Yhteenvetona voidaan todeta, että vertailtaessa kahta MIC-menetelmää Y. pestiksen herkkyysmäärityksessä Etest- ja BMD-menetelmien tulokset korreloivat hyvin kaikkien mikrobilääkkeiden osalta, lukuun ottamatta kloramfenikolia ja trimetopriimi-sulfametoksatsolia, joiden kohdalla Etest-menetelmällä loppupisteittäin määrittäminen oli vaikeaa. Kloramfenikolin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin kohdekohtainen vaihtelu oli myös suurempaa kuin muiden lääkkeiden kohdekohtainen vaihtelu. Etest-menetelmä näyttää olevan hyväksyttävä vaihtoehto BMD:lle siprofloksasiinin, doksisykliinin, gentamysiinin, levofloksasiinin, streptomysiinin ja tetrasykliinin osalta mutta ei kloramfenikolin ja trimetopriimi-sulfametoksatsolin osalta. Koska Y. pestis kasvoi hitaasti MHA:ssa, Etestissä suositellaan 48 tunnin inkubaatiota. Koska tutkimuksessamme ei kuitenkaan ollut yhtään lääkkeille vastustuskykyistä Y. pestis -kantaa, suositellaan myös, että Etestin MIC-arvot, joille Etest ei ole vastustuskykyinen, vahvistetaan BMD:n MIC-vertailutestillä. Suosittelemme myös, että varmistava BMD-testi tehdään kaikille Y. pestis -isolaateille, joiden siprofloksasiini- tai levofloksasiini-Etestin MIC-arvo on 0,25 μg/ml, eli MIC-arvo on herkkyysalueen yläpäässä, koska ei ole tiedossa, voidaanko Etest-menetelmällä havaita kehittymässä oleva resistenssi näille kahdelle lääkkeelle.