El enfoque habitual hacia el estudio de la función de los genes es insertar o inactivar el gen en una célula o en un individuo, y observar los cambios en el comportamiento biológico de la célula o los fenotipos del individuo para identificar su función.

Por lo tanto, el estudio de la función del gen puede llevarse a cabo siguiendo los siguientes dos tipos de estrategias:

• Pérdida de función

• Ganancia de función

Pérdida de función

El knockout de genes es uno de los métodos más utilizados para estudiar la pérdida de función en ratones. El knockout de genes se refiere al descubrimiento de las funciones biológicas de los genes diana mediante el estudio de los organismos que llevan los genes diana inactivados (eliminados). Esta técnica requiere que se realicen cambios en las secuencias parciales de los genes diana, que desactivan las funciones de los genes específicos y, por tanto, inactivan parte o toda la función del gen diana. El knockout génico puede dividirse a su vez en knockout génico convencional y knockout génico condicional.

Knockout génico convencional

• El knockout convencional (abreviatura: KO) se refiere al knockout de ciertos exones vitales, dominios funcionales del gen diana, o incluso de todos los exones, en todas las células de ratón, dando lugar así a la pérdida de expresión del gen diana.

• Los ratones KO llevan las secuencias del gen diana modificado en todos los tejidos y células. Los genes diana no se expresan en los ratones homocigotos

• Los ratones KO se utilizan generalmente para estudiar los efectos de los genes diana o las funciones de las proteínas en la fisiología o la patología.

Noqueo condicional de genes

• El knockout condicional (abreviatura: CKO) es la ingeniería temporal y espacialmente específica del genoma del ratón mediante la limitación de la ingeniería genética a ciertos tipos específicos de células en el ratón o a una etapa específica del desarrollo

• La orientación del gen se utiliza en los ratones CKO para flanquear uno o varios exones importantes del gen objetivo con sitios loxP. La expresión del gen diana era normal antes del cruce con la cepa que expresa la recombinasa Cre. Cuando se cruzan con ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre, el gen diana puede eliminarse en un tejido o tipo de célula específico, y su expresión seguirá siendo normal en otros tejidos o tipos de células.

• Los ratonesCKO se utilizan generalmente para estudiar los genes que causan la letalidad embrionaria, las funciones de los genes o proteínas diana en un tejido o tipo de célula concreto, o el papel de los genes o proteínas diana en un periodo o etapa concretos.

Caso: Aplicación de los modelos de ratón Drd2 KO y Drd2 CKO en la investigación de la respuesta inmunitaria cerebral

Ganancia de función

Estudio de la función de los genes mediante la observación de los cambios en los rasgos biológicos de la célula o del individuo, en los que se ha introducido el gen diana para generar nuevos o mayores niveles de expresión.

Transgénico aleatorio

La transgénesis de inserción aleatoria es la integración al azar de un gen exógeno en el genoma del ratón para generar modelos de ratón con sobreexpresión del gen objetivo. Se utiliza para estudiar los impactos de la sobreexpresión del gen diana en la fisiología y la patología.

La sobreexpresión del gen diana

La secuencia de ADN exógena se expresa de forma estable en los ratones después de ser eliminada en el locus del gen Gt (ROSA) 26Sor del ratón, también conocido como Rosa26. La expresión del gen exógeno también puede ser específica de tejido o inducida por fármacos.

• Útil para experimentos de sobreexpresión de la función de genes y proteínas

• Puede utilizarse para experimentos de rescate de fenotipos KO

Knock-in de genes

Knock-in (abreviatura: KI) se refiere a la introducción de mutaciones específicas o secuencias de ADN exógenas en el lugar del gen objetivo.

(1) Introducción de una mutación de base en el gen diana para imitar un modelo de enfermedad genética humana.

(2) Introducción de un gen reportero, como EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ y Luciferasa, en el gen endógeno murino para observar el patrón de expresión del gen diana.