Abstract
Antecedentes y objetivo. Una herramienta fiable de predicción no invasiva para el cribado, diagnóstico y/o estadificación del cáncer colorrectal (CCR) antes de la cirugía es fundamental para la elección del tratamiento y el pronóstico. Métodos. Se recuperaron y revisaron los pacientes ingresados para el tratamiento inicial del CCR entre el 1 de enero de 2015 y el 31 de diciembre de 2018. Se analizaron los registros de células natural killer (NK) CD16+CD56+ según los estadios del CCR. Resultados. El número de participantes calificados en los pacientes sanos, en estadio I, en estadio II, en estadio III y en estadio IV de CCR fue de 60, 66, 60, 70 y 68, respectivamente. Hubo una diferencia significativa en las células NK CD16+CD56+ circulantes entre el grupo sano y el grupo con CCR (), así como entre el grupo sano y el grupo con CCR en estadio III o IV ( y 0,001, respectivamente). El porcentaje de células NK CD16+CD56+ circulantes en los linfocitos se correlacionó negativamente con la aparición de CCR. Al comparar el conjunto de casos de CCR en estadio I y II con el conjunto de casos de CCR en estadio III y IV utilizando las células NK CD16+CD56+ circulantes, el área bajo la curva de características operativas del receptor fue de 0,878. Utilizando un valor de corte óptimo del 15,6%, la OR fue de 0,06 (0,03, 0,11), la sensibilidad del 86,5%, la especificidad del 72,5%, el valor predictivo positivo del 74,2% y el valor predictivo negativo del 85,5%. Conclusiones. Las células NK CD16+CD56+ circulantes pueden utilizarse como herramienta de cribado y diagnóstico/estadificación del CCR.
1. Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) tiene una incidencia de aproximadamente un millón al año y causa la muerte de casi 700.000 personas cada año, lo que lo sitúa como el cuarto cáncer más mortal del mundo . La actual estrategia de cribado del CCR se enfrenta a una baja sensibilidad y/o especificidad en las pruebas basadas en las heces, a tediosos pasos de preparación del intestino antes de los exámenes radiográficos y a un alto riesgo de perforación en los exámenes endoscópicos . De hecho, la mejor prueba de cribado y seguimiento para el CCR debería ser fácil de completar y repetir, especialmente teniendo en cuenta los casos no resecables de hasta el 25% en el momento del diagnóstico y la tasa de recurrencia del 50% en los casos en fase temprana después de la cirugía.
La estadificación y el pronóstico del CCR se basan principalmente en la patología después de los procedimientos quirúrgicos . Un immunoscore de consenso en secciones de parafina para la clasificación y el pronóstico del CCR fue un ejemplo práctico . Aunque varios estudios han empleado biomarcadores complementarios y no invasivos en el diagnóstico del CCR, todavía se carece de una herramienta de predicción fiable con alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico y/o la estadificación del CCR antes de la cirugía.
Se sabe que el sistema inmunitario está implicado en el desarrollo y la progresión del CCR . Se ha demostrado que la infiltración inmunitaria de diferentes células inmunitarias en el CCR está relacionada con la metástasis y el pronóstico . Además, las células inmunitarias circulantes pueden reflejar la respuesta inmunitaria local en el microambiente del tumor, proporcionando así información potencialmente importante sobre la progresión de la enfermedad en el CCR. Las células asesinas naturales (NK), como un importante subconjunto de las células inmunitarias, cuya actividad se desencadena por un equilibrio evolutivo y delicado entre las señales activadoras e inhibidoras recibidas por los receptores de la superficie celular, se consideran objetivos interesantes para los estudios traslacionales y clínicos .
En el presente estudio, analizamos las células NK doblemente positivas CD16 y CD56 en los pacientes sanos y en diferentes estadios del CCR antes del tratamiento inicial, tratando de averiguar el valor de las células NK CD16+CD56+ en la predicción y la estadificación previa al tratamiento del CCR.
2. Métodos
Se trata de un estudio de cohortes retrospectivo realizado en el 2º Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin, un hospital terciario del noreste de China. Se obtuvo la aprobación del Comité de Ética Institucional antes de la recopilación de datos, y se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes en el momento del ingreso.
Se recuperaron y revisaron los registros clínicos de los pacientes que fueron admitidos para el tratamiento inicial del CCR entre el 1 de enero de 2015 y el 31 de diciembre de 2018 en el Departamento de Oncología. Los pacientes incluidos debían disponer de datos de células NK previos al tratamiento (el más reciente antes de la primera cirugía), así como de CCR primario confirmado histológicamente. La estadificación se basó en la terminología de metástasis en los ganglios tumorales (TNM). Se excluyeron los pacientes con un diagnóstico poco claro, complicados con otros cánceres, ingresados tras tratamientos previos para el CCR, con otras enfermedades crónicas (como enfermedades cardiovasculares y endocrinas) o con infecciones víricas o bacterianas. En el grupo de control se inscribieron participantes sanos de edad e IMC equiparados (sin quejas clínicas que acababan de realizar un examen físico anual en el momento de la inscripción).
Se recogieron muestras de sangre venosa periférica en ayunas de todos los participantes antes del tratamiento (para el grupo de CCR) o el día del examen anual (para los controles sanos) en un tubo recubierto de heparina y se conservaron a 2-8°C. Se transfirieron 100 μl de sangre recién recogida a un tubo de flujo específico. Se añadieron 20 μl de un reactivo TBNK BD Multitest de 6 colores (Ref # 644611, BD, USA, que incluye CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, y CD8 APC-Cy7) para el estudio por citometría de flujo de acuerdo con el manual de fabricación, dentro de cuyo panel CD16+CD56+ cuantificó específicamente las células NK dentro de la población de linfocitos. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad y se trató con 2,5 ml de tampón de lisis de hematíes (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La mezcla se lavó dos veces con tampón PBS, se resuspendió y se fijó en 0,5 ml de PBS que contenía 0,9% de formaldehído (Sigma-Aldrich), y se analizó utilizando un sistema de citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences) mediante el software FACSDiva™ versión 8.0 (BD Biosciences). Se analizaron al menos 20.000 células en la puerta P1 de cada muestra.
2.1. Análisis estadístico
Los datos discretos se expresaron como el número de casos (porcentajes) y se analizaron mediante la prueba o la prueba exacta de Fisher, junto con la odds ratio (OR) y el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%), lo que fuera aplicable. Los datos continuos se mostraron como el y se analizaron mediante la prueba -. Se utilizó el área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC) para mostrar el valor de la predicción. Para el análisis estadístico se utilizó SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY). Se consideró una diferencia significativa de dos colas.
3. Resultados
Durante el período de estudio preestablecido, ingresaron en nuestro hospital 2.714 pacientes con CCR. Según los criterios de inclusión preestablecidos, se incluyeron en nuestro estudio 66 pacientes en estadio I, 60 en estadio II, 70 en estadio III y 68 en estadio IV. En el grupo de control se incluyeron otros 60 participantes sanos de edad e IMC similares. No hubo diferencias significativas en cuanto a la edad, el sexo, el peso corporal, la altura o el IMC entre los controles sanos y los casos de CCR o entre los distintos grupos (, Tabla 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
# prueba entre todos los grupos. Prueba ANOVA entre todos los grupos. Prueba entre el grupo de control sano y los otros grupos correspondientes. -prueba entre el grupo de control sano y los otros grupos correspondientes. Valor $ de los casos sanos frente a los casos de CCR, prueba o -prueba.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.1. El valor predictivo de las células NK CD16+CD56+ circulantes en el CCR
Hubo una diferencia significativa en las células NK CD16+CD56+ circulantes entre el grupo sano y los casos de CCR (, Tabla 1). El porcentaje de células NK CD16+CD56+ circulantes en los linfocitos se correlacionó negativamente con la aparición de CCR.
Se empleó la curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para mostrar el papel de las células NK CD16+CD56+ en la predicción del CCR. Al comparar los controles sanos con los casos de CCR en su conjunto (figura 1), el área bajo la curva (AUC) fue de 0,725 (tabla 2). Utilizando un valor de corte óptimo del 19,7%, la OR fue de 0,08 (0,04, 0,15), la sensibilidad del 80,0%, la especificidad del 76,9%, el valor predictivo positivo (VPP) del 44,0% y el valor predictivo negativo (VPN) del 94%.4%.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
AUC: área bajo la curva. Número de casos por encima del umbral/número total de casos en los grupos correspondientes.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Células NK CD16+CD56+ circulantes en diferentes estadios de casos de CCR
No hubo diferencias en las células NK CD16+CD56+ circulantes entre el grupo sano y el grupo de CCR en estadio I o II ( y , respectivamente), pero existen diferencias significativas entre el grupo sano y el grupo de CCR en estadio III o IV (, , y , respectivamente, Tabla 1). Dado que no había diferencias en las células NK CD16+CD56+ entre el grupo sano y el grupo de CCR en estadio I o II, al comparar el grupo de controles sanos + casos de CCR en estadio I+II con el grupo de casos de CCR en estadio III+IV (Figura 2), el AUC fue de 0,892 (Tabla 2). Utilizando un valor de corte óptimo del 15,6%, la OR fue de 0,07 (0,04, 0,12), la sensibilidad del 84,4%, la especificidad del 72,5%, el VPP del 80,5% y el VPN del 77,5%.
Al comparar el conjunto de casos de CCR en estadios I y II con el conjunto de casos de CCR en estadios III y IV (Figura 3), el AUC fue de 0,878 (Tabla 2). Utilizando un valor de corte óptimo del 15,6%, la OR fue de 0,06 (0,03, 0,11), la sensibilidad del 86,5%, la especificidad del 72,5%, el VPP del 74,2% y el VPN del 85,5%.
4. Discusión
En términos generales, basándose en su expresión de CD56, las células NK pueden subdividirse en CD56bright y CD56dim. Las primeras células están asociadas a la inmunorregulación y a la producción de citoquinas proinflamatorias, mientras que las segundas son citotóxicas . El CD16 (FcγRIII) en las células NK media la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos , y la presencia del CD16 excluye por tanto la participación de ciertas células NK correlacionadas con las células T o B.
Recientemente, dos estudios utilizaron CD3-CD56+ como marcadores de las células NK. Un estudio informó de la presencia de subconjuntos de células NK en pacientes con CCR, con la conclusión de que «el porcentaje de células tipo NKT CD16+ se asoció de forma independiente con una menor supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CCR» . Sin embargo, los autores sólo incluyeron un número limitado de pacientes, y la estratificación por diferentes estadios, así como la división de la población de células NK CD56bright y CD56dim, diluyeron aún más la potencia de sus datos. Además, algunos de esos pacientes ya habían recibido tratamiento radiológico antes de la recogida de células NK, lo que podría introducir heterogeneidad (una mezcla de pacientes tratados inicialmente y posteriores al tratamiento) en la población de pacientes agrupados. Otro estudio informó de una correlación negativa entre las células NK periféricas y el estadio TNM del CCR, con una diferencia significativa en las células NK entre los sanos y los estadios I y II, y los sanos y el estadio IV, pero no entre los sanos y el estadio III. Esta tendencia inconsistente podría deberse al pequeño número de pacientes inscritos en cada grupo. En nuestro estudio, recogimos un mayor número de pacientes, y sólo se inscribieron para el análisis los pacientes sin tratamiento previo, lo que podría mostrar la condición corporal natural bajo la carga del CCR. Por lo tanto, nuestros datos, al ser homogéneos, son aplicables como prueba de cribado antes del tratamiento inicial.
Otro poder de nuestro estudio reside en la exclusión de los casos de infección viral o bacteriana. Existen receptores activadores y receptores inhibidores en la superficie de las células NK . Los receptores activadores de las células NK, como los ejemplificados por Ly49H, KIR2DL3 o KIR3DS1, son necesarios para eliminar las infecciones por citomegalovirus , virus de la hepatitis C o virus de Epstein-Barr, respectivamente. Por otro lado, los receptores inhibidores de las células NK, como se ejemplificó con CD94-NKG2A , o KIRs , también están involucrados en el caso de la infección viral. El equilibrio entre los receptores activadores e inhibidores se mantiene por medio de la unión receptor-ligando . Los receptores directos tipo Toll (TLR) pueden ser activados por el lipopolisacárido, un componente de las bacterias gramnegativas. También se ha informado de que la estimulación de los TLR en las células NK está implicada en la activación de las células NK . Por lo tanto, la exclusión de los casos de infección viral o bacteriana reducirá la heterogeneidad de esos casos en el análisis de los casos de CCR.
Ha habido informes sobre el pronóstico del CCR basados en la tinción inmunohistoquímica para detectar la mutación o el polimorfismo de los genes , o la activación , que sólo es factible después de los procedimientos quirúrgicos. Una categoría de biomarcadores circulantes para el CCR entra en el ámbito de la regulación génica (microARN o metilación) . Otra categoría reside en el análisis metabolómico del suero . En este sentido, las células NK CD16+CD56+ circulantes tienen un papel predictivo tanto en el cribado como en la estadificación antes de los procedimientos quirúrgicos.
5. Conclusión
En resumen, encontramos que el porcentaje de células NK CD16+CD56+ circulantes se correlacionó negativamente con la aparición de CCR y la estadificación del mismo. Utilizando un valor de corte de 19,7% y 15,6%, el porcentaje de células NK CD16+CD56+ circulantes fue capaz de diferenciar entre los casos sanos y los de CCR o el estadio I+II y III+IV, respectivamente.