Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) se utiliza ampliamente en la medicina popular. La glicirricina, un compuesto activo de G. glabra, posee actividad antiinflamatoria. Este estudio investiga el extracto de metanol de G. glabra y la glicirricina para el tratamiento de la neovascularización corneal (NVC). G. glabra se extrajo en metanol acuoso al 70%. Para el análisis de la composición química se utilizaron pruebas fitoquímicas, cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se preparó una solución tópica de extracto de metanol de G. glabra (2% p/v) y glicirricina (1% p/v) en solución salina normal. Después de la quemadura de la córnea (1 N NaOH), los animales se dejaron sin tratar durante una semana para que apareciera la neovascularización en todos los grupos. Los tratamientos comenzaron el día 7 y continuaron durante los siguientes 21 días consecutivos. Los animales fueron tratados con 3 gotas de diversas soluciones tópicas tres veces al día. Se utilizó el análisis fotográfico digital y los estudios histológicos para la evaluación de la NVC. El análisis fitoquímico del extracto de metanol de G. glabra mostró la presencia de saponinas, fenoles, carbohidratos, flavonoides y proteínas. La TLC y la HPLC confirmaron la presencia de glicirricina. El análisis fotográfico del extracto y del grupo tratado con glicirricina mostró una considerable disminución de la NVC. El estudio histológico de los grupos tratados con G. glabra y glicirricina mostró la ausencia de vasos sanguíneos con fibras de colágeno correctamente dispuestas. Este estudio demostró que G. glabra y la glicirricina pueden utilizarse para el tratamiento de la NVC. El aislamiento guiado por bioensayos puede conducir a la preparación de soluciones oftálmicas para el tratamiento de la NVC.

1. Introducción

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) es originaria de la región mediterránea, del centro del sur de Rusia y de Asia, y ahora se cultiva ampliamente en toda Europa y Oriente Medio. El regaliz tiene un alto valor nutricional y se utiliza en los alimentos desde la antigüedad. En los alimentos, se utiliza principalmente como agente edulcorante. También tiene propiedades para inhibir la sensación de sed . El aceite de regaliz está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y tiene aplicaciones en varios productos alimenticios como bebidas, pasta de dientes, chicles y cosméticos . La G. glabra se ha utilizado ampliamente en la medicina popular para el tratamiento de diferentes enfermedades. Las hojas de G. glabra se utilizan para el tratamiento de heridas, las raíces para la diabetes, la enfermedad de Graves y la flatulencia, y el tallo para el tratamiento de la tuberculosis. También se utiliza como afrodisíaco. El extracto de metanol de las partes aéreas de G. glabra mostró actividad antimicrobiana contra varias especies bacterianas . El extracto acuoso de metanol de G. glabra inhibió la proliferación in vitro e in vivo de células tumorales de ascitis de Ehrlich y mostró actividad antiangiogénica en ensayos in vivo, peritoneales y de membrana corioalantoidea. El regaliz también mostró efectos antiagregantes plaquetarios y también se ha utilizado como hierba medicinal para aliviar la tos desde la antigüedad. Las raíces de regaliz chino inhiben el crecimiento de Plasmodium falciparum y Leishmania donovani en estudios in vitro. Además, se ha informado de que el regaliz tiene actividades antibacterianas y antivirales.

G. glabra contiene varios componentes químicos, como saponinas, flavonoides, isoflavonoides, estilbenoides y cumarinas. Los constituyentes activos en las saponinas son la glicirricina, el ácido liquirético y el glicirretol. En los flavonoides, los componentes activos son la liquirtina, la liquiritigenina y la neoliquiritina. En los isoflavonoides, son la glabridina, la glabrona, la glizarina y el galbreno. Los componentes activos en las cumarinas son la liqcumarina y la umbeliferona . Por último, en los estilbenoides, el componente activo son los dihidroestilbenos . La glicirricina es una sal potásica y cálcica del ácido glicirrícico. Se trata de un glucósido de saponina que, tras la hidrólisis, da lugar al ácido glicirretínico. La glicirricina, también conocida como ácido glicirrícico, es el principal componente activo (10 a 25%) del extracto de raíz de G. glabra. La glicirricina ayuda a inhibir el cáncer de pulmón y los fibrosarcomas. En Japón, se utiliza para el tratamiento de la hepatitis C desde hace más de 60 años. Además, la glicirricina mostró propiedades proapoptóticas en un modelo de hepatocitos de lesión hepática colestática. El ácido glicirretínico resultó ser un potente inhibidor de la apoptosis y la necrosis inducidas por los ácidos biliares. Se ha descubierto que miembros de los flavonoides como la isoliquiritigenina y la licochalcona poseen actividades antioxidantes, antitumorales, antiinflamatorias y antiangiogénicas.

La córnea es un tejido transparente, avascular y externo del ojo. Su transparencia es necesaria para la claridad de la visión. En condiciones normales, la avascularidad de la córnea se mantiene mediante un equilibrio entre factores angiogénicos y antiangiogénicos. El cambio de este equilibrio hacia los factores angiogénicos provoca la neovascularización corneal (NVC) . La NVC es una condición patológica en la que se pierde la transparencia de la córnea debido al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde la región del limbo del ojo. El desarrollo de la NVC conduce a una reducción de la transparencia de la córnea y, en consecuencia, provoca un deterioro visual, normalmente la pérdida de la visión central, o incluso puede dar lugar a la ceguera.

Aunque la causa exacta de la NVC aún no está completamente identificada, varias condiciones patológicas como la inflamación, la infección, la degeneración y los trastornos traumáticos pueden inducir la NVC. El uso de lentes de contacto también induce la hipoxia, que en última instancia puede conducir a la NVC. Entre estos factores, las enfermedades infecciosas de la córnea son la causa más importante de la NVC. En la actualidad, las opciones de tratamiento de la NVC incluyen medicamentos como los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), los esteroides y la ciclosporina, terapias con láser como la fotocoagulación térmica con láser de argón, el trasplante de membrana amniótica y el trasplante de limbo. Sin embargo, todos los tratamientos disponibles presentan desventajas como su elevado coste, su escasa eficacia y sus graves efectos secundarios.

Existe una necesidad imperiosa de encontrar tratamientos nuevos y alternativos para la NVC. En el pasado, se observó que los extractos y compuestos con actividades antiinflamatorias y antiangiogénicas tienen el potencial de tratar la NVC. Basándose en la información etnofarmacológica y en otros datos científicos sobre las actividades antiinflamatorias y antiangiogénicas del extracto de G. glabra y de su principal constituyente químico, la glicirricina, se llevó a cabo el presente estudio para evaluar su potencial para el tratamiento de la NVC. Se descubrió que el extracto de G. glabra detuvo eficazmente la NVC, pero la glicirricina resultó ser relativamente menos eficaz para detener el desarrollo de la NVC en el modelo animal.

2. Materiales y métodos

2.1. Material vegetal

Las raíces de G. glabra se compraron en junio de 2015 en una tienda de hierbas auténticas en Abbottabad, Pakistán. La identificación del espécimen (número de vale gg-09-R/15) fue confirmada por el Dr. Abdul Nazir, profesor adjunto del Instituto COMSATS de Tecnología de la Información, Abbottabad, Pakistán, y el espécimen de la planta se depositó en el Departamento de Farmacia del Instituto COMSATS de Tecnología de la Información, Abbottabad, Pakistán.

2.2. Productos químicos

La glicirricina (pureza del 75%) se adquirió en Sigma Aldrich, Estados Unidos. El HCl de ketamina (Indus Pharma, Pakistán), el HCl de xilacina (FARVET, Perú), el HCl de proparacaína (Alcon Laboratories, Inc., EE.UU.) y la solución salina normal (Otsuka Pakistan Ltd.) se adquirieron en una farmacia local.

2.3. Procesamiento y extracción

El material vegetal seco se molió y se extrajo sumergiendo el material en polvo (745 g) en metanol acuoso al 70% (3 L) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó ocasionalmente con una varilla de acero inoxidable durante dos semanas para obtener el máximo de extracto. El extracto se filtró a través de un paño de muselina seguido de papel de filtro Whatman número 42 (125 mm). El extracto se concentró utilizando un evaporador rotatorio de vacío (Yamato Rotary Evaporator, RE 801; Corea del Sur) con el baño de agua ajustado a 40°C. El rendimiento porcentual final del extracto fue del 12,2%.

2.4. El extracto crudo se sometió a un análisis fitoquímico preliminar para todos los componentes químicos principales utilizando pruebas químicas estándar. Para los alcaloides, el extracto (500 mg) se agitó con 5 mL de HCl al 1% y se calentó suavemente durante 1 minuto utilizando un baño de agua. A continuación, se tomó 1 mL de esta solución y se añadieron 0,5 mL de reactivo de Wagner. El desarrollo de turbidez o precipitados indicó la presencia de alcaloides. Para los esteroides, se utilizó la prueba de Salkwoski en la que se añadieron 2 mL de cloroformo para disolver 100 mg de extracto en un tubo de ensayo. A continuación, se añadieron cuidadosamente 2 mL de H2SO4 concentrado para formar la capa inferior. En la capa superior se formó un color verde que indicaba la presencia de esteroides. Para las saponinas (prueba de espuma), se disolvieron 3 mg de extracto en 10 mL de agua destilada y se agitaron vigorosamente en un tubo de ensayo y se dejaron reposar durante 1 minuto. El desarrollo de espuma consistente indicó la presencia de saponinas. Para los flavonoides (prueba de acetato de plomo), se añadió 1 mL de solución de acetato de plomo (5%) a 1 mg del extracto de la planta en un tubo de ensayo. Se dejó reposar la mezcla sin perturbarla. La formación de precipitados de color amarillo indicó la presencia de flavonoides. Para los fenoles (prueba de cloruro férrico), se tomaron 2 mg de extracto en un tubo de ensayo y se añadieron 3 gotas de cloruro férrico al 10%. La aparición de un color negro azulado indicó la presencia de fenoles. Para los glucósidos (prueba de nitroprusiato), se añadió el extracto de metanol con unas gotas de hidróxido de sodio al 10% y luego se añadió nitroprusiato de sodio a la solución anterior. La aparición de un color azul indicó la presencia de glucósidos en el extracto. Para los azúcares reductores, se añadió la solución de Fehling (A y B) al extracto acuoso de metanol (100 mg/mL) en un tubo de ensayo. La solución resultante se calentó en un baño de agua durante 10 minutos. La formación de un precipitado rojo-anaranjado fue una indicación positiva de la presencia de azúcares reductores. Para la detección de proteínas, el extracto de la planta se trató con unas gotas de ácido nítrico concentrado. La formación de un color amarillo indicó la presencia de proteínas.

Se utilizó la cromatografía en capa fina (TLC) para la identificación de varios compuestos, especialmente el principal constituyente químico, la glicirricina. El extracto y la glicirricina se aplicaron a placas de TLC recubiertas con gel de sílice (60 F254) y se revelaron en n-butanol, ácido acético y agua destilada (12 : 3 : 5) como fase móvil. Se utilizó sulfato cérico como reactivo de pulverización para la visualización de los compuestos en las placas de TLC.

Para el análisis del extracto y de la glicirricina se utilizó la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Perkin Elmer, Series 200 Auto sampler). Se aplicaron las siguientes condiciones durante la toma de huellas de HPLC: Detector UV-Vis (200-700 nm), columna (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), fase móvil que era acetonitrilo y agua en la proporción de 10 : 90, volumen de inyección que era de 20 μL, caudal que era de 1 mL/min, y se utilizó un filtro de membrana de 0,45 μm. Los compuestos se detectaron a una longitud de onda de 254 nm. Para la G. glabra, se tomaron 100 mg del extracto en 25 mL de metanol acuoso al 70% en un matraz volumétrico (50 mL) y se sonicó durante 50 min a temperatura ambiente. La solución estándar de glicirricina se preparó disolviendo 5 mg de glicirricina en metanol y el volumen final se hizo de 10 mL con adición de metanol. Las soluciones madre de extracto de G. glabra y de glicirricina se filtraron y desgasificaron por ultrasonidos antes del análisis.

2.5. Animales

Se utilizaron conejos de ambos sexos (1,5-2 kg) como modelo animal en el presente estudio. Estos fueron adquiridos en el mercado local de la ciudad de Abbottabad. El protocolo experimental fue aprobado bajo las regulaciones del comité ético del CIIT Abbottabad para los animales con el número de aprobación PHM.Eth/SP.14-714-CIIT-ATD el 11 de julio de 2015, el cual sigue todas las recomendaciones de la Guía Ética de Animales de los NIH (1986). Los conejos fueron separados al azar en cuatro grupos con un mínimo de cinco animales por grupo. A continuación, cada conejo fue marcado en la oreja dentro de los grupos para garantizar su separación durante todo el procedimiento experimental. Los animales se colocaron en la condición estándar y se les dio libre acceso a la comida y al agua.

2.6. Inducción de la quemadura de la córnea en el ojo del conejo

Para la inducción de la NVC, se dañaron los ojos derechos de todos los animales experimentales mediante una quemadura con álcali (solución de hidróxido de sodio 1 N) utilizando el protocolo informado . Brevemente, los animales de experimentación fueron sometidos a una inanición durante 12 h antes de comenzar el experimento. Los animales fueron anestesiados mediante una inyección intramuscular de HCl de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) en combinación. A continuación, se abrió el ojo derecho del conejo con un espéculo de alambre para poder inducir correctamente la quemadura con álcali. Aproximadamente, 2 minutos antes de la quemadura, se instilaron unas gotas de proparacaína HCl en el ojo derecho de cada conejo para minimizar la irritación en la córnea. Se utilizó un punzón de papel para producir un disco de 7 mm de papel de filtro Whatman. Los discos de papel de filtro se sumergieron suavemente en una solución de hidróxido de sodio 1 N durante unos 90 s y posteriormente se colocaron en el centro de la córnea durante 2 minutos para inducir quemaduras graves. Los ojos se lavaron con solución salina normal para humedecerlos y obtener esterilidad. Después de la quemadura corneal, los conejos se mantuvieron durante una semana para el desarrollo de la NVC sin más tratamientos.

2.7. Preparaciones de las gotas oculares y protocolos de tratamiento

La solución tópica de extracto de G. glabra (2% p/v) se preparó en solución salina normal utilizando 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y unas gotas de Tween-80 y se mezcló utilizando un mezclador vortex. Del mismo modo, se preparó una solución de glicirricina (1% p/v) en solución salina normal. Para la preparación del vehículo, se mezcló dimetilsulfóxido (DMSO) (10% v/v) y unas gotas de Tween-80 en solución salina normal. La dexametasona (0,1%) (ALCON-COUVREUR, Bélgica) se obtuvo en el mercado local y se utilizó como control positivo. Todas las soluciones tópicas se envasaron en goteros especiales adquiridos en el mercado local y se almacenaron a 4°C. Los tratamientos se iniciaron el 7º día de las quemaduras de la córnea y se continuaron durante los siguientes 21 días consecutivos. Los ojos de los diferentes grupos de animales se trataron tópicamente con 3 gotas de varias soluciones tres veces al día. El primer grupo recibió tratamiento con extracto de G. glabra, mientras que el segundo grupo fue tratado con glicirricina. El tercer grupo recibió el vehículo y el cuarto grupo tratado con dexametasona (0,1%) se consideró como control positivo.

2.8. Análisis microscópico y fotográfico

La progresión de la NVC en todos los grupos se supervisó periódicamente mediante un microscopio de lámpara de hendidura (Olympus-CX21) con una fuente de luz artificial conectada manualmente. Las fotografías se tomaron con una cámara fotográfica digital (DSC-W70, Sony, Japón) con un aumento ×12, una distancia del objetivo de 85 mm, un índice de zoom del 100% y una distancia de disparo de 29 cm. Las fotografías se tomaron los días 1, 7, 14, 21 y 28 y se almacenaron en el ordenador para su uso posterior.

2.9. Estudios histológicos de los tejidos de la córnea

El último día del experimento, los animales fueron sacrificados con dislocación cervical. Se extrajeron los ojos enteros y se conservaron en formol neutro al 10%. Tras la conservación, se extrajeron muestras de tejido corneal de todo el ojo utilizando cuchillas quirúrgicas. A continuación, los tejidos se transfirieron a frascos perforados (cápsula) utilizando pinzas. Estos tejidos se sumergieron en formol (15%) y luego en solución salina de formaldehído alcohólico (15%) durante 3 horas cada uno. A continuación, los tejidos se deshidrataron utilizando grados ascendentes de alcohol (etanol). Durante este proceso, los tejidos se trataron con alcohol al 70% y al 80% durante 2 h cada uno y, finalmente, con alcohol al 100% durante 6 h. En el siguiente paso, las muestras se aclararon en xileno puro durante 6 h (3 cambios cada 2 horas en diferentes frascos). A continuación, los tejidos se incrustaron en cera de parafina utilizando una cabina caliente automática con un rango de temperatura de 58 ± 5°C. Los tejidos se sumergieron en parafina durante 4 h (2 h en 2 turnos y en diferentes frascos). Después de esto, se obtuvieron secciones de 4 μm de tejidos corneales utilizando un micrótomo rotatorio (Thermo Fisher Scientific, Alemania). Para una correcta fijación, se colocaron gotas de albúmina de huevo sobre los portaobjetos y se montó una única sección de tejido sobre ella. A continuación, los portaobjetos se colocaron durante 2 horas en una incubadora de convicción mecánica de precisión (calentador de portaobjetos) (modelo 4EM número de cat. 31574). La tinción histológica con hematoxilina & eosina (H&E) se llevó a cabo mediante diferentes pasos que incluían la desparafinación, la hidratación, la tinción con hematoxilina, la decoloración (tinción con eosina) y la deshidratación.

3. Resultados

3.1. El análisis fitoquímico del extracto de G. glabra

Se realizó un análisis fitoquímico del extracto de G. glabra para averiguar la presencia de las principales clases de constituyentes fitoquímicos. Los resultados revelaron la presencia de flavonoides, carbohidratos, proteínas, saponinas y fenoles, como se muestra en la Tabla 1. La presencia de alcaloides, fitoesteroles y glucósidos no se confirmó en la presente investigación (Tabla 1).

Componentes fitoquímicos Prueba química Presencia Alcaloides Prueba de Wagner – Prueba del fitosterol Prueba de Salkowski – Saponinas Prueba de la espuma/espuma + Flavonoides + Fenoles Prueba del cloruro férrico + Glicósidos Prueba del nitroprusiato – Carbohidratos Prueba de Fehling + Proteínas Prueba xantoproteica +

Tabla 1

El análisis fitoquímico del extracto de G. glabra mostró la presencia de saponinas, flavonoides, fenoles, carbohidratos y proteínas.

Los resultados obtenidos de las pruebas químicas se confirmaron además mediante el análisis de TLC. El extracto se estandarizó con referencia a su principal constituyente químico, la glicirricina. Los resultados se muestran en la figura 1. Los valores del factor de retención (Rf) de los componentes del extracto se compararon con la glicirricina. Como se muestra en la figura 1, el valor de Rf para la mancha visible A del extracto de G. glabra fue de 0,43, mientras que para la B fue de 0,15. El valor de Rf para la glicirricina (punto visible C) también fue de 0,15. Sobre la base de estos resultados, puede confirmarse que la glicirricina estaba presente en el extracto como uno de los compuestos principales.

Figura 1

Perfil de TLC para el análisis del extracto de G. glabra y la glicirricina utilizando placas de TLC recubiertas de gel de sílice y n-butanol : ácido acético : agua (12 : 3 : 5) como fase móvil.

Se llevó a cabo el análisis por HPLC del extracto crudo derivado de G. glabra y de la glicirricina para obtener los picos principales de varios constituyentes químicos en los extractos y para confirmar la presencia del compuesto principal (glicirricina). El cromatograma resultante mostró varios picos en diferentes tiempos de retención para el extracto de G. glabra, como se muestra en la Figura 2(b). El cromatograma también mostró un pico a un tiempo de retención de 40 minutos para la glicirricina, como se muestra en la Figura 2(a). De forma similar a la glicirricina, también se observó un pico en el cromatograma para el extracto en el mismo tiempo de retención (40 min), como se muestra en la Figura 2(a). Los resultados confirmaron la presencia de glicirricina como componente principal en el extracto de G. glabra.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Cromatograma de HPLC de (a) glicirricina y (b) extracto de G. glabra. Las condiciones de la HPLC fueron la longitud de onda (254 nm), la fase móvil (acetonitrilo : agua), el volumen de inyección (20 μL) y el caudal (1 mL/min).

3.2. Análisis de la NVC de los grupos tratados con extracto de G. glabra, glicirricina, vehículo y control positivo

Para observar la eficacia del tratamiento con extracto de G. glabra y glicirricina, se supervisó la progresión de la NVC bajo microscopio y mediante análisis fotográfico en diferentes días de tratamiento. Las fotografías tomadas en diferentes días de tratamiento se muestran en la Figura 3 para los grupos tratados con el extracto y con el vehículo. Se observó al microscopio y también se puede ver en las fotografías que, incluso en la primera semana de tratamiento, el grosor del neovaso (NV) aumenta en el grupo tratado con extracto. Sin embargo, se observó una disminución más rápida del grosor del vaso a partir de la segunda semana (Figura 3) y continuó hasta el final del experimento. Los resultados obtenidos mostraron que el extracto de G. glabra hizo desaparecer casi por completo la NVC el día 28 del experimento en comparación con el grupo de control con vehículo (Figura 3). El grupo tratado con dexametasona (control positivo) (Figura 3) también mostró la misma tendencia que el grupo tratado con extracto de G. glabra. La observación microscópica y el análisis fotográfico también revelaron que la glicirricina también mostró efectos positivos en el bloqueo de la NVC. Cuando se analizaron los ojos utilizando un microscopio de alta resolución, se observó que hay un desvanecimiento gradual de los vasos sanguíneos y la reanudación de la forma normal en el último día de tratamiento (Figura 3) con la presencia de sólo unos pocos NV. Estos resultados mostraron que la actividad anti-VNC de la glicirricina fue ligeramente inferior a la del extracto crudo.

Figura 3

Fotografías representativas de las VNC en el extracto de G. glabra, glicirricina, vehículo y dexametasona (control positivo) en los días 0, 7, 14, 21 y 28. Hay una disminución gradual del diámetro y el grosor del NV, y casi desaparece en el último día del experimento. El grupo tratado con glicirricina también mostró una disminución del diámetro y el grosor del NV, pero la actividad fue menor que la del extracto de G. glabra.

3.3. Análisis histológico de la córnea tratada con G. glabra y glicirricina en comparación con el vehículo y el grupo de control positivo

El análisis histológico se realizó para conocer la presencia de inflamación, la recuperación de las fibras corneales y la existencia de vasos sanguíneos. Las microfotografías representativas teñidas con H&E se han mostrado en la Figura 4. La histología del ojo izquierdo de cada animal se consideró como tejido de referencia, ya que no se indujeron quemaduras por álcalis y se mantuvo en condiciones normales. En la córnea de referencia, no había crecimiento epitelial ni de NV, ni cambios en la morfología, como se muestra en la Figura 4. En el grupo de control con vehículo (Figura 4), se observaron extensos vasos sanguíneos y alteraciones del colágeno, lo que puso de manifiesto el desarrollo de la NVC. Por otro lado, la histología de la córnea tratada con extractos de G. glabra mostró que la región corneal casi se ha recuperado a la normalidad con vasos sanguíneos casi disminuidos y colágenos en forma normal. El análisis histológico del grupo tratado con glicirricina (Figura 4) mostró que, aunque la región de la córnea se ha recuperado en su mayor parte hasta alcanzar su forma normal, hay algunos indicios de que todavía hay daños. Había algunos signos de hipertrofia epitelial y también se observaban menos vasos sanguíneos. Estos resultados mostraron que la glicirricina es eficaz para inhibir la NVC, pero en menor medida que el extracto de G. glabra. En comparación, la microfotografía de portaobjetos teñidos con H&E de la córnea tratada con dexametasona (Figura 4) mostró una reducción del crecimiento epitelial y de la formación de vasos sanguíneos en la región de la córnea, pero las fibras de colágeno se encontraban en cierto modo en un estado destruido y dispuestas de forma desordenada.

Figura 4

Microfotografía histológica del extracto de G. glabra y del grupo tratado con glicirricina en comparación con el control con vehículo y el control positivo.

4. Discusión

El VNC es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Se ha estimado que alrededor del 4,14% de la población mundial está afectada por esta enfermedad. La principal causa molecular de la NVC es el desequilibrio entre los factores angiogénicos y antiangiogénicos. Entre estos factores, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) promueve la propagación, el paso y la formación de tubos de las células endoteliales vasculares. Por lo tanto, existe la posibilidad de tratar la NVC con agentes anti-VEGF; sin embargo, no se puede tratar completamente sólo con la terapia anti-VEGF, ya que también hay algunos reguladores adicionales de la angiogénesis . Además, la inflamación y la angiogénesis son procesos interdependientes, por lo que el tratamiento con anti-VEGF puede no tener éxito. En el pasado, se observó que los extractos y compuestos con actividad antitumoral y antiinflamatoria son útiles para inhibir la NV y la NVC. El extracto crudo de G. glabra ha mostrado un efecto antiinflamatorio, mientras que el extracto acuoso de G. glabra ha inhibido la angiogénesis en ensayos in vivo . Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que el extracto de G. glabra y su principal constituyente químico, la glicirricina, podrían tener la capacidad de controlar la NVC y, por lo tanto, se llevó a cabo el presente estudio.

Es importante conocer la composición química de cualquier extracto antes de evaluar sus actividades biológicas. Por lo tanto, se llevó a cabo un análisis fitoquímico del extracto de G. glabra, que reveló que contiene importantes constituyentes químicos como flavonoides, carbohidratos, proteínas, saponinas y fenoles. Estudios anteriores informaron de la presencia de saponinas, flavonoides, alcaloides, terpenoides, taninos y glucósidos, pero no se detectaron hidratos de carbono, proteínas, flobatanos, compuestos fenólicos ni antraquinonas. Otro estudio mostró la presencia de carbohidratos, compuestos fenólicos y proteínas junto con otros componentes en el extracto de G. glabra . Las razones de estas diferencias pueden ser la estación y la edad de las plantas recolectadas.

La TLC y la HPLC confirmaron la presencia de glicirricina en el extracto crudo. Los cromatogramas de TLC y HPLC del extracto revelaron un compuesto con un valor Rf (0,15) y un tiempo de retención (unos 40 minutos) como el de la glicirricina estándar. Estos resultados se desvían un poco de las observaciones anteriores, en las que la glicirricina estándar se manchó a 0,22 . La razón principal de esto podría ser el uso de diferentes reactivos y condiciones en el estudio anterior y en el presente. En el estudio anterior, se utilizó cloroformo, metanol y agua como fase móvil y ácido anisaldehído-sulfúrico como reactivo de pulverización, mientras que en el presente estudio se utilizó n-butanol, ácido acético y agua destilada como fase móvil y sulfato de cerio como reactivo de pulverización.

Se ha informado de que la glicirricina, uno de los principales componentes de G. glabra, posee actividades antiinflamatorias y anticancerígenas. Los resultados del presente estudio revelaron que el extracto de G. glabra tuvo éxito en la inhibición de la NVC, ya que las NVC prácticamente disminuyeron después de 21 días de tratamiento (Figura 3). Al ser el compuesto principal, se pensó que la inhibición de la NVC podría deberse a la glicirricina. El análisis de la glicirricina contra la NVC mostró algunos efectos positivos en la inhibición de la NVC, pero no fue capaz de disminuir completamente los vasos sanguíneos de la región corneal (figura 3). La glicirricina es un glucósido triterpenoide (saponina) con ácido glicirretínico. Anteriormente, se informó de que el ácido glicirretínico tiene un efecto directo sobre los receptores mineralocorticoides y produce efectos similares a los de la inflamación, lo que puede ser una de las razones de los menores efectos de la glicirricina. Este estudio sugiere que, junto con la glicirricina, algunos otros compuestos pueden ser responsables de la inhibición de la NVC en el extracto de G. glabra.

También era importante estudiar los efectos del extracto de G. glabra y la glicirricina en la anatomía microscópica (microanatomía) del tejido corneal. Por lo tanto, se realizó un análisis histológico cuyos resultados confirmaron los efectos anti-CNV del extracto de G. glabra. Además, no había ningún signo claro de toxicidad, ya que las fibras de colágeno estaban dispuestas en un conjunto en la córnea de los animales tratados con el extracto de G. glabra. La anatomía microscópica de la córnea tratada con extracto de G. glabra era muy similar a la del control normal. Por otra parte, no había signos de vasos sanguíneos en la córnea tratada con dexametasona (control positivo), pero las fibras de colágeno seguían desordenadas, lo que mostraba que la dexametasona podía tener algunos efectos tóxicos en la córnea. Aunque estudios anteriores también informaron de los efectos tóxicos de la dexametasona, se necesitan más investigaciones para confirmar este fenómeno a nivel microanatómico. También es importante mencionar que, aunque la glicirricina tuvo un gran éxito en el control de la NVC, no pudo recuperar completamente la córnea dañada por el álcali y también se observaron algunos vasos sanguíneos.

5. Conclusiones

De los resultados se puede concluir que las gotas oftálmicas del extracto crudo de G. glabra inhibieron el crecimiento de los vasos en la región corneal, lo que indica que sería eficaz en el tratamiento de la NVC. Además, el principal compuesto de G. glabra, la glicirricina, no pudo impedir completamente la NVC. Esto significa que otro(s) constituyente(s) puede(n) ser también responsable(s), junto con la glicirricina, de la actividad anti-VNC del extracto. Para ello, se requiere una mayor investigación sobre el aislamiento guiado por bioensayos para la identificación del componente o componentes principales responsables de la inhibición de la NVC. Además, los estudios moleculares también serán útiles para averiguar el mecanismo molecular exacto del extracto de G. glabra en el tratamiento de la NVC.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Contribuciones de los autores

Syed Luqman Shah y todos los demás autores contribuyeron por igual a este trabajo. El artículo final ha sido aprobado por todos los autores.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Christie Ronge, del Departamento de Farmacia, Froedtert &el Colegio Médico de Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, su ayuda en las correcciones lingüísticas/gramaticales.