Durante la última década, las técnicas quimiogenéticas y optogenéticas han revolucionado la neurociencia integradora al proporcionar nuevas herramientas para manipular de forma reversible la actividad de poblaciones específicas o sistemas de neurotransmisores con mayor selectividad (Sternson y Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). En comparación con la optogenética, que permite una modulación neuronal rápida y fásica con alta resolución temporal, la quimiogenética permite una modulación más extendida de los sistemas, lo que resulta especialmente útil para estudios centrados en fenómenos tónicos (por ejemplo, la investigación de la implicación de la dopamina en los procesos motivacionales; Whissell et al., 2016). Entre las herramientas quimiogenéticas, los receptores de diseño activados exclusivamente por drogas de diseño (DREADDs) son ampliamente utilizados y se denominan como un sistema biológico de «cerradura y llave» para la manipulación selectiva de la actividad celular a través de las vías de señalización de la proteína G. Desarrollado por primera vez de forma muy elegante por el grupo de Roth (Armbruster et al., 2007), este receptor acoplado a la proteína G (GPCR) es un receptor muscarínico: la cerradura, que fue mutada para responder sólo al óxido de clozapina-N (CNO), la llave, un metabolito derivado del antipsicótico atípico clozapina, por lo demás con, potencialmente, ninguna actividad farmacológica.

Sin embargo, desde 2016, algunas publicaciones han planteado cuestiones preocupantes en relación con el uso de CNO. En primer lugar, dosis relativamente altas de CNO (10 mg/kg) administradas sistémicamente pueden tener una actividad farmacológica fuera del objetivo, como lo demuestra la inducción de efectos conductuales en ratas y ratones no mediados por las DREADD (MacLaren et al., 2016; Gómez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Además, Gómez et al. (2017) demostraron que la CNO no atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica, puede presentar una baja afinidad de unión a las DREADD y fue retro-metabolizada en clozapina, convirtiéndose en el verdadero efector de las DREADD. Basándose en estas sorprendentes observaciones, sugirieron el uso directo de dosis bajas de clozapina (0,1 mg/kg) para activar las DREADD en lugar de la CNO. Sin embargo, el uso de dosis bajas de clozapina en lugar de grandes dosis de CNO que se convierten gradualmente en clozapina conlleva dos limitaciones importantes. En primer lugar, no es evidente que la clozapina, en inyección aguda o en difusión prolongada, actúe sobre las DREADDs de la misma manera (Mahler y Aston-Jones, 2018). En segundo lugar, dado que la clozapina es un agente antipsicótico atípico, tiene numerosas dianas endógenas como los receptores serotoninérgicos, muscarínicos o dopaminérgicos, con afinidades relativamente fuertes (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby y Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) y es probable que induzcan efectos fuera del objetivo, incluso con dosis bajas. De hecho, se ha descubierto que la dosis de 0,1 mg/kg de clozapina recomendada para los experimentos de DREADD aumenta significativamente el comportamiento relacionado con la ansiedad en ratones (Manzaneque et al., 2002), así como en ratas (un efecto que también hemos observado; R. Goutaudier y S. Carnicella, observaciones no publicadas), donde la clozapina también afecta a la locomoción a través de una posible sedación y perjudica la flexibilidad cognitiva (Ilg et al., 2018).

Aunque la aparición de estos efectos puede depender de la especie, la cepa o el sexo utilizados, y puede ser muy discreta (ya que no todas las dimensiones de comportamiento se ven afectadas); tienen el potencial de interferir significativamente con el rendimiento de los animales en una variedad de tareas de comportamiento. El estrés y la ansiedad elevados pueden ser factores de confusión en los estudios de memoria o dolor, por ejemplo (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Además, el comportamiento relacionado con las drogas de abuso o los trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia, la ansiedad o la flexibilidad cognitiva pueden modificar todo el fenotipo (Floresco et al., 2009; Koob y Schulkin, 2018). En base a estas observaciones, es necesario tomar importantes precauciones con la clozapina para evitar estudios conductuales sesgados.

¿Sería más selectiva una nueva molécula diseñada específicamente para las DREADD? El compuesto 21 (C21) es un ligando sintético de DREADD, desarrollado en 2015 (Chen et al., 2015) y parcialmente caracterizado in vitro así como in vivo en 2018 (Thompson et al., 2018). Una vez más, a dosis bajas (<3 mg/kg), se describió que carecía de efectos conductuales fuera del objetivo y que era capaz de alterar el comportamiento de los animales que expresaban DREADD. Este estudio fue reforzado por Jendryka et al. (2019), que realizaron experimentos farmacocinéticos y farmacodinámicos con ratones y C21 (3 mg/kg). Demostraron que 30 min después de la administración de C21 la concentración de la molécula en el LCR era >10 veces mayor que la EC50 estimada para la activación de DREADD (LCR = 40 nm y EC50DREADDs = 3 nm), y sin retro-metabolización en clozapina. Sin embargo, los resultados de un reciente estudio de preimpresión de BioRxiv en ratas, ratones y macacos (Bonaventura et al., 2018) sugieren que, aunque el C21 presenta una baja penetración cerebral, una dosis de 1 mg/kg ya puede modificar la función cerebral en ratones de tipo salvaje. Además, se observó una débil afinidad y ocupación por los DREADD in vitro en rodajas de cerebro de rata, así como in vivo en ratones y macacos en un estudio de tomografía por emisión de positrones. Basándose en la misma investigación experimental que para el C21, propusieron, como alternativa, otros dos ligandos, el JHU37152 y el JHU37160, que poseen una mayor potencia in vivo para los DREADD y potencialmente menos efectos fuera del objetivo (Bonaventura et al., 2018). Aunque esta nueva generación de ligandos DREADD parece prometedora, debido a su novedad, todavía están poco caracterizados y siguen siendo estructuralmente homólogos a la clozapina y a la CNO. Por lo tanto, una caracterización exhaustiva en la investigación celular a la conductual será crucial para excluir los potenciales escollos encontrados para la CNO.

Una solución alternativa para mejorar la selectividad de los enfoques quimiogenéticos sería utilizar otra combinación de cerradura y llave. Así, el receptor κ-opioide-DREADD (KORD) es un GPCR inhibidor mutado derivado del receptor κ-opioide humano (Vardy et al., 2015). En comparación con los DREADD clásicos que se unen a compuestos de clozapina, CNO, C21 o JHU, KORD se compromete con la salvinorina B, un metabolito similar a la droga del agonista selectivo de KOR, la salvinorina A. Aunque este enfoque quimiogenético se utilizó elegantemente en combinación con un DREADD activador para crear un sistema «ON y OFF» dentro de la misma población neuronal (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), sigue siendo utilizado de forma marginal porque solo reduce la actividad neuronal durante un corto periodo de tiempo (Aldrin-Kirk y Björklund, 2019). Además, la salvinorina B muestra cierta afinidad por el KOR endógeno a altas concentraciones y aún no se ha beneficiado de una caracterización en profundidad como se realiza actualmente para los compuestos relacionados con el DREADD (Roth, 2016). Sustituir el GPCR por un canal iónico mutado, otro receptor de diseño alternativo llamado canales iónicos activados por ligando (LGICs) es una opción desarrollada por el laboratorio Stenson (Magnus et al., 2011). En comparación con los DREADDs, los LGICs combinan el dominio de unión al ligando de un receptor nicotínico mutado con el dominio del poro iónico de otro receptor elegido para crear un canal iónico quimérico. Al igual que los DREADDs, este canal híbrido es activado por un pequeño agonista derivado de la quinuclidinil benzamida, un agonista del receptor nicotínico de acetilcolina α7, y permite el intercambio de iones a través de la membrana neuronal. Entre otras limitaciones propias de este enfoque (Aldrin-Kirk y Björklund, 2019), también comparte con los DREADD el uso de un ligando farmacológico que puede interactuar potencialmente con los receptores endógenos, dependiendo de las condiciones experimentales. Por último, todos estos cierres derivan de los receptores endógenos y, como tales, no consiguen librarse de las limitaciones intrínsecamente ligadas a la farmacología.

Más allá de estos avances recientes y de los interrogantes que quedan, cabe plantearse una pregunta crucial: ¿se encontrará alguna vez una llave totalmente selectiva e inerte? Probablemente no. Es esencial tener en cuenta que las DREADDs son herramientas quimiogenéticas que combinan la genética y la farmacología. Aunque los enfoques genéticos ofrecen un potente control de la expresión de las cerraduras (es decir, las DREADD) en poblaciones celulares específicas, o en subpoblaciones con enfoques condicionales, derivan de GPCRs endógenos y, como tales, están sujetos a los mismos límites que la farmacología clásica para la llave. Por lo tanto, es poco probable que se encuentren moléculas que presenten una alta afinidad de unión a las DREADD sin afinidad a algunos de los numerosos receptores que ya están presentes en el cerebro y que están estrechamente relacionados con las DREADD. Por ejemplo, la clozapina tiene una afinidad muy alta por las DREADDs, pero también por el receptor serotoninérgico 5-HT2 (Ki = 10-8 para ambos; Armbruster et al., 2007; Gómez et al., 2017), y una alta afinidad por una amplia gama de otros GPCRs (Ki = 10-7 a 10-6; Armbruster et al., 2007). Incluso los ligandos sintéticos diseñados específicamente para esta técnica quimiogenética presentan afinidades sustanciales por los receptores endógenos. Por ejemplo, aunque el JHU37152 y el JHU37160 tienen una menor afinidad por los receptores 5-HT que la clozapina, tienen un perfil general de diana similar al de este fármaco, con una afinidad incluso mayor por los receptores muscarínicos (Bonaventura et al., 2018), lo que sugiere efectos potencialmente más fuertes fuera del objetivo. El C21 también muestra una mayor afinidad por el receptor histaminérgico H1 que por los DREADD (Ki > 10-8 y Ki = 10-7,2, respectivamente; Thompson et al., 2018) y un mayor potencial de unión a los receptores opioides que la clozapina (Bonaventura et al., 2018). Para minimizar los escollos de este potente enfoque, independientemente de la elección de la clave, deben tomarse precauciones críticas (Fig. 1).

Primero, antes de cualquier experimento conductual, deben probarse las condiciones experimentales para encontrar el mejor ligando y la dosis o dosis óptimas, dependiendo del enfoque experimental. Las DREADD no deben considerarse como una herramienta «llave en mano»; deben realizarse experimentos celulares, neuroquímicos o electrofisiológicos antes del estudio conductual (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) para confirmar la eficacia del ligando a la dosis elegida en el sistema de interés. Además, también deben incluirse animales de control sin DREADD para verificar la ausencia de efectos neurobiológicos inespecíficos del ligando o del receptor per se que pueda ser activado por un neurotransmisor o tener una actividad constitutiva (Saloman et al., 2016).

En segundo lugar, cuando sea posible, deben ensayarse dos ligandos de DREADD diferentes para confirmar que los efectos conductuales observados están específicamente mediados por DREADD. Las acciones farmacológicas específicas sobre las DREADDs serían similares, pero los efectos fuera del objetivo pueden diferir.

En tercer lugar, y el punto más crítico, deben utilizarse controles farmacológicos convencionales. Debe aplicarse la misma filosofía que en farmacología y, al igual que en los experimentos neurobiológicos, deben integrarse grupos de animales transgénicos sin expresar DREADD (por ejemplo, vectores virales vacíos de DREADD) para verificar los efectos selectivos del ligando y la dosis elegida (Smith et al., 2016, Campbell y Marchant, 2018; Mahler y Aston-Jones, 2018; para un ejemplo de estudios experimentales que siguen este diseño, véase también Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Esta afirmación puede parecer trivial, pero la búsqueda de un ligando selectivo absoluto y el atractivo de este enfoque ya han dado lugar a algunos estudios conductuales demasiado confiados, a veces realizados en ausencia total de este control.

En conclusión, las DREADD proporcionan una forma precisa de manipular los circuitos neuronales y el comportamiento, y ofrecen una gran alternativa a la optogenética para manipular tónicamente una subpoblación celular específica, abriendo así nuevas e interesantes vías de investigación. Sin embargo, al igual que las propiedades térmicas de la luz en la optogenética pueden dar lugar a efectos inespecíficos (véase también Owen et al., 2019), se necesita una mayor precaución con la quimiogenética, y los controles estándar deben ser obligatorios. Hay que reconocer las limitaciones de la DREADD y dedicar tiempo a evitar o controlar los posibles efectos fuera del objetivo y a verificar que este enfoque no induce un sesgo per se. El uso de los puntos fuertes de la genética, prestando atención a los puntos débiles de la farmacología, maximizará el potencial de este enfoque.