Imunofluorescence (IF) je běžný morfologický přístup používaný ke stanovení distribuce subcelulárních složek. V testu IF jsou vyžadovány protilátky, které jsou konjugovány s fluorescenčními barvivy. Protilátka specificky rozpoznává antigen vazbou na epitop cíle a fluorofor se detekuje pod fluorescenčním mikroskopem. Proto lze subcelulární složky vizualizovat na tmavém pozadí. IF lze také použít jako alternativní semikvantitativní metodu analýzy ke sledování exprese zájmového objektu.

Existují tři typy IF: přímá IF, nepřímá IF a kombinovaná IF.

Přímá IF používá jednu primární protilátku, která je konjugována s fluorescenčním barvivem.

Přímá IF používá k barvení dvě protilátky: primární protilátku, která se specificky váže na epitop, a odpovídající sekundární protilátku konjugovanou s fluorescenčním barvivem.

Kombinovaná IF je kombinací přímého a nepřímého barvení IF.

Tabulka 1. Srovnání přímé, nepřímé a kombinované IF.

Typ IF	Přímá	Nepřímá	Kombinace
Schematické schéma		.
Výhody	Rychlé barvení Dostupné pro protilátky ze stejného hostitele Méně ne.specifický signál na pozadí	Zesílení sekundární signalizace Jediná sekundární protilátka může detekovat více primárních protilátek ze stejného hostitele Primární protilátce lze přiřadit různé sekundární protilátky s různými fluorescenčními barvivy	Sekundární zesílení pro slabou signalizaci K dispozici pro protilátky ze stejného hostitele
Nevýhody	Méně citlivé z důvodu chybějícího zesílení sekundární signalizace	Časová náročnost.náročné Vyžadují protilátky od různých hostitelů Možnost zkřížené reaktivity protilátek	Vícestupňové barvení

Mezi tři typy IF, je nejoblíbenější nepřímá metoda IF.

Přístup IF lze použít na tkáňových řezech, kultivovaných buněčných liniích a jednotlivých buňkách. Postup IF je podobný imunohistochemii (IHC).

• Odběr a fixace vzorků

Vzorky musí být po odebrání tkáně rychle fixovány a u malých zvířat, jako jsou hlodavci, je lepší provést předběžnou fixaci, ačkoli infuze srdce se 4% formaldehydem nebo paraformaldehydem. Doporučuje se, aby tkáně nebyly silnější než 10 mm a objem fixativa by měl být alespoň 15-20krát větší než objem tkáně. Fixace je velmi důležitá pro zachování morfologie a struktury buněk i integrity antigenu. Proto je třeba fixační roztoky pečlivě vybírat podle různých antigenů a vzorků tkání.

Tabulka 2. Fixační strategie pro dílčí antigeny.

• Dehydratace a vložení

Dehydratace je při přípravě tkáňových řezů nutná z následujících důvodů:
1. Parafínový řez: Parafín je nemísitelný s vodou.
2. Zmražený řez: Rozmražené krystalky ledu by zničily morfologii buněk.

Dehydratace se vždy provádí ponořením tkáně do závaží s rostoucím gradientem roztoku ethanolu nebo roztoku sacharózy.

Následně lze vzorky tkání vložit přidáním roztaveného parafínu pro parafínové řezy, zatímco pro zmrazené řezy se přidává sloučenina OCT. Tento krok zajišťuje správnou tvrdost pro vzorky měkkých tkání a umožňuje snadné řezání tkáně.

• Řez a barvení

Vložené tkáně lze řezat na tenké plátky mikrotomem nebo zmrazovacím mikrotomem. O tloušťce řezů je třeba rozhodnout podle průměru buněk a účelu IF testu. Tenčí plátky (≤10 μm) se doporučuje před barvením přímo připevnit na adhezivní sklíčka, protože je lze snadno zastavit při vícenásobném promývání. U silnějších řezů (10 ~ 30 μm) se dosáhne lepšího zobrazení pomocí metody volně plovoucích řezů, protože primární protilátka může proniknout na obě strany řezu. Volně plovoucí řezy se po obarvení upevní na sklíčka. Volně plovoucí řezy malých tkání, jako jsou kořeny dorzálních ganglií (DRG) myší, se obtížně provádějí a vzorek se snadno ztratí. Proto se u některých malých vzorků tkání doporučuje metoda lepených řezů. Pokud se jedná o protilátku konjugovanou s fluorescenčním barvivem, měly by se kroky barvení provádět ve tmě.

Sáhněte po protokolech IF:

• Stick section
• Free floating section
• Cultured cells

• Imaging and analysis

Pozitivní signalizace se virtualizuje pod fluorescenčním mikroskopem na tmavém pozadí. Místo zájmu se obvykle určí souběžným barvením proteinu, jehož umístění bylo známo. Alternativně lze pro kvantitativní analýzu měřit množství pozitivních buněk nebo intenzitu fluorescence pozitivní signalizace. Například silnější intenzita fluorescence odkazuje na relativně vysokou expresi cílového proteinu.

Obrázek 1. Pracovní postup IF na tkáňových řezech.

IF i IHC jsou výkonné přístupy pro morfologickou analýzu s důležitým diagnostickým a prognostickým využitím. Ve svém výzkumu se musí zabývat několika rozdíly:

Tabulka 3. Srovnání IHC a IF

.

.

	IHC	IF
Metoda značení	Chromogenní	Fluorescenční
Krok zpracování	Více jako potřebný substrát	Méně
Obrázek	Ultra citlivá signalizace „rozmazaná“ reakce výsledkem sraženiny vytvořené chromogenním enzymovým komplexem	Vysoké rozlišení Vícenásobné barvení
Mikroskop	Světelný mikroskop	Fluorescenční mikroskop
Stabilita	Stabilní pro let	Méně stabilní kvůli fotobleachingu
Příklad (myší hipokampus)

.