The phylogeny of Holometabola

Analyzovali jsme celkem 1 343 ortologických genů v poměru 1:1 (tj, skupiny ortologických sekvencí, nazývané také ortologické skupiny (OGs)) a při zahrnutí i publikovaných dat data z celkem 88 druhů (tab. 1). Sedm speciálně navržených rozhodujících souborů dat, které jsme analyzovali k řešení našich sedmi fylogenetických otázek, se každý skládal z podmnožiny taxonů a genů z kompletního souboru dat, s výjimkou souboru dat 1, který je totožný s kompletním souborem dat. Sedm otázek, taxonomické skupiny, které jsme vybrali jako relevantní pro zodpovězení otázek, a počty druhů a OG pro každý dataset jsou uvedeny v tabulce 2. Pro každou datovou sadu jsme provedli 1) rekonstrukci ML stromu a 2) mapování se čtyřmi shluky pravděpodobnosti (FcLM) (viz tabulka 3). Výsledky jsou shrnuty na obrázku 1 (viz doplňkový soubor 1: Obrázky S1-S7 pro přítomnost a nepřítomnost genů v souborech dat, Další soubor 2: Obrázky S8-S15 pro úplné fylogenetické stromy a Doplňkový soubor 3: Obrázky S17-S25 pro úplné výsledky FcLM).

Analýza datasetu 1 přinesla Hymenoptera jako sesterskou skupinu ke všem zbývajícím holometabolním řádům jak při rekonstrukci ML stromu, tak při FcLM (tabulka 3, obrázek 1). Tento vztah byl již obnoven v několika studiích s více geny (např. ), a to na základě dat celého genomu, ale omezeného výběru taxonů . Dříve publikované analýzy morfologických dat přinesly rozporuplné výsledky, jako například Hymenoptera + Mecopterida u Beutela a Gorba versus Hymenoptera + zbývající holometabolní řády u Beutela a kol . Potenciální problémy topologických artefaktů v těchto analýzách, které jsou způsobeny konvergentní redukcí v mnoha morfologických znakových systémech, podrobně diskutovali Friedrich a Beutel a Beutel et al . Umístění Hymenoptera jako sesterské skupiny ke všem zbývajícím holometabolním řádům znamená, že předpokládané synapomorfie Hymenoptera a Mecopterida (např. jednoduchý drápek larev, sklerotizovaná sitoforová destička dospělců; viz ) jsou ve skutečnosti homoplazie.

Naše analýzy datového souboru 2 přinesly monofyletické Neuropteroidea (tj, klad zahrnující Neuropterida, Coleoptera a Strepsiptera) s maximální podporou v rekonstrukci ML stromu a silnou podporou ve FcLM (tabulka 3, obrázek 1). Neuropteroidea nebyla podpořena jako klad v Beutel et al. , ale byla shledána monofyletickou v mnoha předchozích studiích , i když ve většině případů se slabou podporou nebo bez ní.

Nenašli jsme žádný signál pro parafyletickou Megaloptera, jak o ní hovoří Beutel et al. a Winterton et al (datový soubor 3, tabulka 3, obrázek 1). V rámci Neuropterida naše ML analýzy maximálně podpořily vztah sesterské skupiny mezi Raphidioptera a Neuroptera + Megaloptera, který byl také podpořen více než 2/3 všech kvartetů ve FcLM (dataset 4, tabulka 3, obrázek 1). Fylogenetické vztahy mezi řády neuropteridů byly diskutovány kontroverzně se dvěma alternativními hypotézami: Raphidioptera + Megaloptera jsou monofyletické (např. ) nebo Neuroptera + Megaloptera jsou monofyletické (např. ). Naše výsledky silně podporují druhou hypotézu.

Analýza souboru dat 5 přinesla nejednoznačné výsledky s ohledem na možný klad zahrnující Coleoptera a Strepsiptera (Coleopterida) (tabulka 3, obrázek 1). Vyřešení tohoto dlouhodobého problému je obtížné vzhledem k extrémně modifikované morfologii (např. ) a výrazně odvozeným genomickým rysům endoparazitických Strepsiptera („problém Strepsiptera“, ; „hmyz z vesmíru“, ). V nejnovějších příspěvcích byly nalezeny důkazy pro monofyletické Coleopterida (např., ). Studie založené na molekulárních datech však zůstaly ve svých výsledcích nejednoznačné. Coleopterida nebyla podpořena všemi soubory dat, které analyzovali McKenna a Farrell . Výsledky Wiegmanna a kol. byly založeny na relativně malém souboru genů a vykazovaly pouze slabou podporu pro tento klad. Niehuis a kol. analyzovali nukleotidové sekvence celých genomů holometabolního hmyzu a zjistili dobrou podporu Coleopterida, ale výběr taxonů nezahrnoval žádné řády neuropteridů. V naší studii má Coleopterida podporu v ML stromu (s maximální bootstrapovou podporou), ale ne v analýzách FcLM (tab. 3, obr. 1). V ML stromu jsou Strepsiptera umístěny v rámci Coleoptera (stejně jako v některých stromech McKenny a Farrella ), avšak se slabě podpořenými vztahy (Additional file 2: Figure S12). Dále jsme analyzovali, zda nesoulad mezi rekonstrukcí ML stromu a FcLM analýzami zmizel s ohledem na rozdělené ML a FcLM analýzy s použitím různých modelů na různých oddílech. Rozdělené analýzy by mohly omezit potenciální chybné specifikace modelu a mohly by přinést shodné topologie. Nesoulad mezi ML a FcLM analýzami však nezmizel (tab. 3, doplňkové soubory 2 a 3). To znamená, že chybné specifikace modelu způsobené analýzami bez rozdělení nejsou zdrojem inkongruence (viz také a diskuse v nich). Data a analytické postupy naší studie zřejmě nepřinesly jednoznačné řešení otázky, zda Coleopterida je, či není monofyletická skupina. Nicméně důkazy z morfologie jasně naznačují, že monofyletická Coleopterida (viz také ) je nejpravděpodobnějším výsledkem.

Pro testování monofylie Mecopterida, kladu zahrnujícího Amphiesmenoptera (Lepidoptera + Trichoptera) a Antliophora (Diptera + Siphonaptera + Mecoptera), jsme analyzovali dvě verze souboru dat 6, abychom zohlednili dvě možné hypotézy (soubor dat 6a, b; tabulky 2 a 3). Obě analýzy obnovily monofyletické Mecopterida se silnou podporou (tabulka 3, obrázek 1). Monofyletická Mecopterida, jak ji navrhl Hinton pod názvem Panorpoidea (nebo panorpoidní komplex), neměla dobrou podporu u Kjera et al. a Wiegmanna et al. a podporu měla pouze v bayesovských analýzách morfologických znaků u Beutela et al. Niehuis et al. nalezli nejistou podporu pro tento klad na základě dat celého genomu, ale neúplný výběr taxonů – genomy Neuropterida, Trichoptera, Siphonaptera a Mecoptera nebyly dosud sekvenovány – snížil rozhodnost tohoto souboru dat ohledně otázky monofyletických Mecopterida.

Naše analýzy jednoznačně potvrdily monofylitu Amphiesmenoptera (Trichoptera + Lepidoptera) (obr. 1). Tuto hypotézu jsme však netestovali pomocí speciálně navrženého souboru dat, protože nikdy nebyla vážně zpochybněna .

V rámci Antliophora, která vykazovala maximální bootstrapovou podporu v ML stromu, jsme nalezli sesterský skupinový vztah Mecoptera a Siphonaptera, rovněž s maximální bootstrapovou podporou a s maximální podporou v FcLM (soubor dat 7, tabulka 2, obrázek 1). Tento výsledek potvrzuje názory předložené Beutelem a Gorbem , McKennou a Farrellem a Wiegmannem a kol. i když v posledně jmenované studii neměl klad Mecoptera + Siphonaptera dostatečnou podporu. Vztah sesterské skupiny mezi Diptera a Siphonaptera, jak byl získán v Beutel et al. (, viz diskuse tamtéž), je na základě našich analýz velmi nepravděpodobný.

Touto studií nepřispíváme k otázce, zda jsou Mecoptera monofyletickou skupinou, protože součástí našeho výběru taxonů byl pouze jeden druh, Nannochorista philpotti. Nicméně morfologická data a analýzy devíti jaderných genů silně naznačují, že Mecoptera skutečně tvoří monofyletickou skupinu.

Shrnem jsme odvodili pevnou fylogenetickou páteř Holometabola se třemi maximálně podporovanými megadiverzními klany Hymenoptera, Neuropteroidea a Mecopterida s přibližně 135 000, 370 000 a 300 000 popsanými druhy. Pro dobře definovanou jednotku zahrnující Neuropteroidea a Mecopterida navrhujeme název Aparaglossata (obr. 1). Název odkazuje na ztrátu paraglossae, jedné z nejnápadnějších apomorfií skupiny (viz níže a tabulka 4).

Naše sestavení souborů dat molekulárních sekvencí a náš design fylogenetické analýzy vykazují některé zásadní rozdíly oproti dřívějším studiím fylogeneze holometabol. Konkrétně i) použili jsme obrovské množství dat získaných pomocí sekvenování nové generace Illumina (tabulka 1). ii) Zajistili jsme rozhodnost našich datových souborů tím, že jsme speciálně navrhli datové soubory pro každou z našich sedmi výzkumných otázek (tabulka 2) (viz ). Rozhodnost znamená, že všechny geny zahrnuté do datové sady jsou pokryty alespoň jedním zástupcem všech taxonomických skupin, které jsou relevantní pro konkrétní studovaný fylogenetický vztah. V souladu s tím má každý soubor údajů 100% pokrytí, pokud jde o přítomnost genů, s ohledem na příslušné taxonomické skupiny. Zajištěním rozhodnosti zmírňujeme potenciálně zavádějící účinky chybějících údajů. Chybějící údaje mohou vést k odvození vysoce podporovaných, ale nesprávných topologií (viz ). iii) Pro každý z našich sedmi souborů dat jsme provedli FcLM (tabulka 3). Reimplementovali jsme FcLM v jazyce RAxML, abychom si poradili s těmito rozsáhlými datovými maticemi, a doplnili jsme metodu o nově napsané skripty, které mapují příslušné výsledky do 2D simplexových grafů. Samotná podpora Bootstrapu u fylogenetických stromů má při analýzách velmi rozsáhlých souborů dat omezenou průkaznost . FcLM je metoda pro identifikaci možné podpory alternativních topologií v souboru dat, tj. metoda pro zobrazení inkongruentního signálu, který nemusí být pozorovatelný ve fylogenetických stromech. Tato studie jako první aplikuje FcLM na rozsáhlé fylogenomické supermatrice. A konečně, iv) všechny datové sady jsme zkontrolovali na přítomnost nepoctivých taxonů. Rogue taxa jsou taxony, které zaujímají více fylogenetických pozic v souboru bootstrapových stromů. Snižují rozlišení a/nebo podporu, například při sestavování bootstrapových konsenzuálních stromů. Odstraněním podvodných taxonů může vzniknout informativnější bootstrapový konsenzuální strom (viz Doplňkový soubor 4, kapitola 4). Všechny naše soubory dat byly bez rogues.

Sestavením souborů dat, jak je zde prezentováno (tj. extrakcí maximálního počtu genů, které mohou přispět k řešení daného fylogenetického vztahu), jsme také zajistili, že odvozené topologie nebyly založeny na libovolném výběru genů s ohledem na jejich vlastní fylogenetický signál. Dell’Ampio et al. ukázali, že výběr genů – pokud není veden úvahami o rozhodnosti souboru dat – může generovat topologicky odlišné stromy, které nicméně mohou všechny vykazovat vysokou podporu. Simon et al. dále ukázali, že geny zapojené do různých biologických drah mohou podporovat různé topologie pro určitý fylogenetický vztah. Lze tedy konstatovat, že fylogenetické stromy odvozené na základě studia pouze souboru několika málo až několika málo genů jsou snadno zkreslené, a nemusí tedy odrážet správný druhový strom. Ačkoli v současnosti nejlepším přístupem k řešení tohoto problému je zahrnutí maximálního možného množství potenciálně informativních dat, budeme muset dále rozklíčovat faktory přispívající k topologickým nesouladům v souborech dat (viz také ).

Fylogenetické studie založené výhradně na morfologii (např. ) také v některých případech přinesly problematická seskupení. Autoři se zabývali a diskutovali zjevné artefakty, které byly způsobeny především paralelní redukcí znakových komplexů (např. letový aparát). Problémy se však ukázaly jako neřešitelné vzhledem k dostupným datům a analytickým postupům . S našimi soubory molekulárních dat jsme byli schopni poskytnout spolehlivá řešení pro většinu interordinačních fylogenetických vztahů v rámci Holometabola (obr. 1 a výše). Pro sledování evolučních změn na fenotypové úrovni jsme použili nejrozsáhlejší morfologický soubor dat, který je v současnosti k dispozici a který zahrnuje 356 znaků zástupců všech holometabolních řádů a pečlivě vybraných outgroup taxonů . Tyto znaky byly formálním přístupem mapovány na fylogenezi založenou na transkriptomech (podrobnosti viz oddíl Metody). To nám umožnilo sledovat a znovu interpretovat evoluční změny četných znaků a provést rekonstrukce půdorysu na základě parsimonie pro všechny klody stromu (viz níže „Evoluce v rámci holometabol“).

Evoluce v rámci Holometabola

Larvy a vývoj

Naše fylogenetické výsledky naznačují, že ancestrální larva Holometabola byla terestrická, orthognátní, vybavená mírně zjednodušenýma, ale výrazně vyvinutýma složenýma očima a dobře vyvinutýma hrudníma nohama. Břišní končetiny a krčky chyběly (obr. 2). Svalový systém byl celkově dobře vyvinutý. Výrazné zjednodušení tykadel a labiálních enditových laloků a s nimi spojených svalů jsou larvální autapomorfie Holometabola. Ortognátní hlava v půdorysu naznačuje, že nejranější holometabolní larvy se živily zvenčí rostlinným materiálem nebo houbami a nehloubily se v substrátu nebo nepronikaly do úzkých štěrbin (např. pod kůru).

Přední aparaglossatanská larva byla pravděpodobně prognatální a vybavená stemmaty. Zda tyto larvy patřily k agilním kampodeidům, jako jsou larvy mnoha brouků (např. Adephaga, Myxophaga , Staphylinoidea), Strepsiptera (první instar), Neuropterida a některých skupin Trichoptera (např. Rhyacophilidae), zůstává nejasné. Je možné, že tento larvální typ je apomorfním stavem charakteristickým pro Neuropteroidea, s paralelním vývojem u Trichoptera. Prognathismus je často spojován s masožravými potravními návyky (Neuropterida, Adephaga a některé polyfágní podskupiny), ale může souviset i s pronikáním úzkými štěrbinami nebo zahrabáváním se do substrátu, jako je tomu u dřevokazných larev Archostemata (Coleoptera), ale i u raných linií lepidopter (např. ). Není tedy jasné, zda byly předpotopní larvy aparaglossatanů predační, či nikoliv. Larvy rodu Mecopterida vykazují určitá zjednodušení (tentorium a antenální segmenty) a zřetelná tendence k redukci charakterizuje larvy antlioforů, zejména larvy rodu Siphonaptera a Diptera. Obě zcela ztratily hrudní končetiny (u Mecoptera zřetelně zkrácené) a vyznačují se zjednodušením hlavových struktur, zejména svalového systému . To odráží rozšířený larvální způsob života u Antliophora, kdy larvy žijí ve svrchní vrstvě půdy, listovém opadu, vlhkých substrátech nebo různých vodních nádržích a živí se převážně měkkými substráty nebo drobnými částicemi. Důležitá otázka, zda byly larvy předků antlioforů terestrické (Lepidoptera, Mecoptera, Siphonaptera, Mecoptera excl. Nannochoristidae, Diptera partim) nebo vodní (Trichoptera, Nannochoristidae, Diptera partim), zůstává nejednoznačná.

Naše fylogenetické výsledky jasně ukazují, že typický holometabolní vývoj s larvami zcela postrádajícími vnější křídelní pupeny („endopterygotní hmyz“) a také postrádajícími cerky patří do půdorysu holometabol (viz také ). Podmínky charakterizující primární larvy strepsipteranů (přítomnost břišního segmentu XI a cerků) a sekundární larvy (vnější křídelní pupeny rozpoznatelné jako vnější konvexity) jsou zřejmě výsledkem zvratů, stejně jako časný výskyt perspektivních složených očí (viz ). Značně imobilní kukly s imobilizovanými mandibulami (pupa adectica) se téměř jistě vyvinuly několikrát nezávisle na sobě. Zdá se pravděpodobné, že pohyblivá kukla s pohyblivými mandibulami, jak je to charakteristické pro Raphidioptera, je předkem holometabol, i když to není potvrzeno formální analýzou znaků.

Dospělci a kladení vajíček

Dospělci holometabol se zřejmě jen nepatrně lišili od půdorysu neopter (Neoptera: všechen okřídlený hmyz kromě Odonata a Ephemeroptera). Cefalické struktury, celý svalový systém, letový aparát a abdominální struktury se zdají být z velké části nemodifikované . Nejhlubší apomorfie u dospělého holometabolního hmyzu souvisí s invaginací pterothorakálních sternitů (např. těsně přiléhající meso- a metakoxy) . Naše údaje nevedou ke spolehlivému posouzení předpotopních potravních návyků dospělců holometabolanů, ale je zřejmé, že krmení v dospělém stadiu hrálo ve srovnání s krmením v larválních stadiích menší roli. Výjimku z tohoto pravidla představují např. draví brouci (např, Dytiscidae a Carabidae) s velmi rychlým postembryonálním vývojem a dlouhověkými dospělci.

Vznik Aparaglossata charakterizují výrazné morfologické proměny znaků: redukce labiálních enditových laloků (paraglossae) včetně svalů, výrazná modifikace orthopteroidního ovipozitoru a případně snížený počet Malpighiových kanálků (také u Acercaria (praví brouci, psocopterani, vši a příbuzní)) . Naše výsledky neumožňují jednoznačnou rekonstrukci ancestrálního stavu letového aparátu u Holometabola a Aparaglossata. Zdá se pravděpodobné, že přibližně stejně velké pterothorakální segmenty (jako u Neuropterida, raných linií lepidopter a Mecoptera) jsou pro Aparaglossata plesiomorfní, ale rekonstrukce ancestrálního stavu tohoto znaku ve formální analýze zůstala nejednoznačná. Jak bylo naznačeno výše, otázka, zda Coleopterida je či není monofylní skupinou, není zcela vyřešena. Zdá se však pravděpodobné předpokládat, že posteromotorismus se vyvinul pouze jednou u společného předka Strepsiptera a Coleoptera, a to se souborem souvisejících znaků, jako je redukce velikosti mezothoraxu, výrazná redukce mezothorakálního svalového systému , a zvětšení velikosti metathoraxu. Výrazný anteromotorismus, jaký je přítomen u Hymenoptera, Trichoptera, „vyšších“ Lepidoptera a Diptera, je možná u Holometabola předkem, ale je možné, že se tento stav vyvinul (sekundárně?, viz výše) několikrát nezávisle (např, téměř stejně velké pterothorakální segmenty u nelesklých Lepidoptera).

Mechanismy spojování křídel se zřejmě vyvinuly nezávisle u Hymenoptera (hamuli jako autapomorfie řádu, viz doplňkový soubor 4, kapitola 5), Trichoptera, Lepidoptera a některých čeledí Neuroptera (u těchto řádů se vyskytují různé mechanismy).

Primární způsob kladení vajíček u Holometabola byl velmi pravděpodobně endofytický, jak lze předpokládat u půdního plánu Hymenoptera („Symphyta“). Tento způsob kladení vajíček je pravděpodobně zachován i v půdoryse Neuropteroidea. Raphidioptera mají modifikovaný, prodloužený ovipozitor, který používají k ukládání vajíček pod kůru nebo do podestýlky. To se podobá ukládání vajíček, jak se předpokládá u půdorysu Holometabola a Hymenoptera; může však jít také o odvozený znak. Úplná nebo téměř úplná redukce prvků primárního ovipozitoru je charakteristická pro Mecopterida a zřejmě souvisí s povrchovým kladením vajíček nebo s kladením vajíček do měkkého substrátu. Naše výsledky většinou potvrzují evoluční scénář pro samičí postabdomen a kladení vajíček, jak je podrobně nastíněn v práci Hünefeld et al. .