Obvyklým přístupem ke studiu funkce genů je vložení nebo inaktivace genu do buňky nebo jedince a pozorování změn v biologickém chování buňky nebo jednotlivých fenotypů za účelem identifikace jeho funkce.

Studium funkce genu lze tedy provádět podle následujících dvou typů strategií:

• Ztráta funkce

• Získání funkce

Ztráta funkce

Knockout genu je jednou z nejčastěji používaných metod studia ztráty funkce u myší. Genovým knockoutem se rozumí objevování biologických funkcí cílových genů studiem organismů, které nesou inaktivované (vyřazené) cílové geny. Tato technika vyžaduje provedení změn v dílčích sekvencích cílových genů, které vyřadí funkce konkrétních genů, a tím deaktivují část nebo celou funkci cílového genu. Vyřazení genů lze dále rozdělit na konvenční vyřazení genů a podmíněné vyřazení genů.

Konvenční vyřazení genů

• Konvenční vyřazení (zkratka: KO) se týká vyřazení určitých životně důležitých exonů, funkčních domén cílového genu nebo dokonce všech exonů ve všech myších buňkách, což vede ke ztrátě exprese cílového genu.

• KO myši nesou upravené sekvence cílového genu ve všech tkáních a buňkách. Cílové geny nejsou u homozygotních myší exprimovány

• KO myši se obvykle používají ke studiu účinků cílových genů nebo funkcí proteinů na fyziologii nebo patologii.

Podmíněný genový knockout

• Podmíněný knockout (zkratka: CKO) je časově a prostorově specifické inženýrství myšího genomu omezením genového inženýrství na určité specifické typy myších buněk nebo na určité stadium vývoje

• U myší CKO se používá cílení genů tak, že se jeden nebo několik důležitých exonů cílového genu obklopí místy loxP. Exprese cílového genu byla před křížením s kmenem exprimujícím rekombinázu Cre normální. Při křížení s transgenními myšmi exprimujícími rekombinázu Cre lze cílový gen vyřadit v určité tkáni nebo typu buněk a jeho exprese zůstane normální v ostatních tkáních nebo typech buněk.

• CKO myši se obvykle používají ke studiu genů, které způsobují embryonální letalitu, funkce cílových genů nebo proteinů v určité tkáni nebo typu buněk nebo úlohy cílových genů nebo proteinů v určitém období nebo stadiu.

Případ: Použití myších modelů Drd2 KO a Drd2 CKO ve výzkumu imunitní odpovědi mozku

Získání funkce

Studium funkce genu pozorováním změn biologických vlastností buňky nebo jedince, do kterého byl vnesen cílový gen za účelem vytvoření nové nebo vyšší úrovně exprese.

Náhodná transgeneze

Náhodná inserční transgeneze je náhodná integrace exogenního genu do myšího genomu za účelem vytvoření myších modelů s nadměrnou expresí cílového genu. Používá se ke studiu dopadů nadměrné exprese cílového genu na fyziologii a patologii.

Nadměrná exprese cílového genu

Exogenní sekvence DNA je stabilně exprimována u myší poté, co je zaklepána do myšího Gt (ROSA) 26Snebo také známá jako genový lokus Rosa26. Exprese exogenního genu může být také tkáňově specifická nebo vyvolaná léčivem.

• Využívá se pro experimenty s nadměrnou expresí funkce genů a proteinů

• Může být použit pro záchranné experimenty pro KO fenotypy

Gen knock-in

Knock-in (zkratka: KI) označuje zavedení specifických mutací nebo exogenních sekvencí DNA v místě cílového genu.

(1) Zavedení základní mutace do cílového genu za účelem napodobení modelu lidského genetického onemocnění.

(2) Zavedení reportérového genu, například EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ a luciferázy, do myšího endogenního genu za účelem pozorování vzorce exprese cílového genu.

.