… (Zhang et al., 2009), způsobila vážné problémy při charakterizaci proteinů Flv4 a Flv2. Nejdříve se spekulovalo, že k takové membránové asociaci dochází prostřednictvím proteinu Sll0218, což je integrální membránový protein se čtyřmi předpokládanými transmembránovými šroubovicemi. Ukázalo se však, že tomu tak není, protože Flv4 z velké části zůstával v membránové frakci i v nepřítomnosti proteinu Sll0218 (mutanty D fl v2 , D sll0218-19 a D sll0218- 19/ fl ag – fl v4) (údaje nejsou uvedeny). Protein Sll0218 je navíc spojen s velkým membránovým komplexem nezávisle na heterodimeru Flv2/Flv4 ( obr. 4). A konečně, úpravou metody dvoufázového dělení pro subfrakcionaci membrán byl protein Sll0218 lokalizován na thylakoidní membráně, zatímco Flv4 a Flv2 v tomto systému mají tendenci asociovat se s plazmatickou membránou (obrázek 2D). Tato druhá asociace se zdála být silně závislá na kationtech (obrázky 2B a 2C). Podobné chování bylo nedávno zaznamenáno u jiného proteinu Synechocystis, ačkoli mechanismus membránové asociace je nejasný (Carmel et al., 2011). Na základě modelu heterodimeru Flv2/Flv4 a zarovnání sekvencí byla na povrchu proteinu rozpoznána některá domnělá vazebná místa pro kovy zahrnující zbytky His, Asp a Glu. Povrchově vázané kovy byly nalezeny také v homologních strukturách. Například fl avodoxinu podobná doména ze Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) má Ca 2+ , a M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG a 1YCH) má na povrchu vázáno několik Zn 2+ (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Ionty kovů na strukturách pocházejí z krystalizačního roztoku, ale některá vazebná rezidua kovů jsou v našem modelu zachována nebo nahrazena podobnými rezidui (viz doplňková tabulka 2 online). Dohromady by tato rezidua mohla být zodpovědná za asociaci Flv2 a Flv4 s membránovou frakcí závislou na kationtech. Na základě analýzy elektrostatického povrchového potenciálu modelu má monomer Flv4 negativněji nabitý povrch (obr. 8B) a obsahuje více předpokládaných vazebných míst pro kovy na povrchu než monomer Flv2 (viz doplňková tabulka 2 online). Vzhledem k tomu, že koncentrace kationtů použitá v izolačním pufru je mnohem vyšší než v reálných fyziologických podmínkách (obr. 2B až 2D), vazba Flv2/Flv4 na membránu in vivo může být přechodná a reverzibilní. Specifi kace Flv2/Flv4 na plasmatickou membránu při rozpadu buňky (obr. 2D) může také souviset s jeho povrchovým nábojem, protože vnitřní povrch plasmatické membrány je negativnější než pravostranná thylakoidní membrána (Barber, 1982; Körner et al., 1985). Povrchový náboj thylakoidní membrány se však může během fotosyntézy dramaticky měnit, což může zprostředkovat tranzitní vazbu Flv2/Flv4 také s thylakoidní membránou. Protein Sll0218 byl jednoznačně lokalizován do komplexu s vysokou molekulovou hmotností v thylakoidní membráně. Zvláštní chování proteinu Sll0218 v konvenčním dvoufázovém systému dělení membránových subfrakcí však naznačuje, že protein Sll0218 není v thylakoidní membráně distribuován rovnoměrně. Je spojen s velkým komplexem, který je jen nepatrně menší než hlavní dimer PSII. Ke snížení poměru PSII dimerních a PSII monomerních komplexů dochází pouze u mutantů postrádajících protein Sll0218 ( D sll0218-19 a D fl v4 ), ale ne u D fl v2 (obr. 5, tab. 1). Proto předpokládáme, že Sll0218 může fungovat jako chaperon při stabilizaci PSII dimeru sestaveného za podmínek vzdušné hladiny CO 2 . Přestože byl komplex PSII izolován jak v monomerní, tak v dimerní formě (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), je všeobecně přijímáno, že in vivo funguje komplex PSII jako dimer u sinic i u vyšších rostlin (Hankamer et al., 1999; Kuhl et al., 2000), zatímco monomerní PSII může být mezistupněm normálního sestavování a oprav PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Ačkoli dimerizace PSII in vivo u sinic byla zpochybňována kvůli použití detergentů pro solubilizaci a analýzu tylakoidních komplexů in vitro (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), existují přesvědčivé důkazy o tvorbě dimerů pomocí mutantních přístupů. Ukázalo se totiž, že malé subjednotky PSII PsbM a PsbT, které se nacházejí na rozhraní monomer-monomer, jsou klíčové pro správné sestavení a opravu PSII (Ohnishi a Takahashi, 2001; Iwai a kol., 2004; Bentley a kol., 2008). Vzhledem k tomu, že protein Sll0218 je exprimován pouze za nízkých (tj. vzdušných) podmínek CO 2, předpokládáme, že sestavování dimerů PSII se liší v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti proteinů Sll0218 (viz níže). Optimalizace fotosyntézy vyžaduje přísnou regulaci mezi absorpcí a přeměnou sluneční energie na energii chemickou a jejím využitím v navazujících metabolických drahách. Pro vodní fotoautotrofy, jako jsou sinice, je CO 2 nezbytným, ale často defi nitivním substrátem. V přírodním prostředí vede nedostatečná dostupnost CO 2 , zejména v kombinaci s vysokým ozářením, k vysokému excitačnímu tlaku na fotosystémy (Huner, 1998) a omezuje rychlost fotosyntézy. Aby se s tím vyrovnaly, je u sinic při nízkém Ci silně indukováno několik mechanismů koncentrace CO 2 , které zvyšují koncentraci CO 2 v okolí ribulosa-1,5-bis-fosfátkarboxylázy/oxygenázy a zároveň indukují cyklický tok elektronů za účelem tvorby většího množství ATP (přehled v Kaplan a Reinhold, 1999; Giordano a kol., 2005; Badger a kol., 2006; Price a kol., 2008). Mikroarray a proteomické studie odhalily stimulon s nízkým obsahem CO 2 (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), jehož součástí je také operon sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ), který je regulován stejně silně jako geny indukovatelného mechanismu koncentrace CO 2 . Geny fl v2 a fl v4 mají také vysokou světelnou odezvu (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). Mutanti s inaktivací fl v4 a fl v2 odhalili vysokou náchylnost k fotoinhibici PSII za podmínek vzdušné hladiny CO 2 (Zhang et al., 2009). Naše nedávné studie exprese operonu navíc odhalily těsnou regulaci tohoto operonu fl v4- fl v2 pomocí malých regulačních RNA (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess a E.-M. Aro, nepublikované údaje). Takto silná indukce a regulace antisense RNA operonu fl v4- fl v2 spolu s pozorovanou ochranou PSII při vzdušné hladině CO a vysoké …

.