Základní informace
Transfekce DNA pomocí elektroporace je zavedená technika, která je použitelná snad pro všechny typy buněk. Poskytuje vysokou frekvenci stabilních transformantů a má vysokou účinnost přechodné genové exprese. Nyní se ukázalo, že elektroporace je účinná při dodávání plasmidové DNA in vivo do různých typů tkání. Elektroporace využívá skutečnosti, že buněčná membrána funguje jako elektrický kondenzátor, který není schopen propouštět proud (s výjimkou iontových kanálů). Vystavení membrán vysokonapěťovému elektrickému poli vede k jejich dočasnému rozpadu a vytvoření pórů, které jsou dostatečně velké na to, aby umožnily makromolekulám (i menším molekulám, jako je ATP) vstoupit do buňky nebo ji opustit. Opětovné uzavření membránových pórů je přirozený proces rozpadu, který se při teplotě 0 °C opožďuje.
Po dobu, kdy jsou póry otevřené, může do buňky a nakonec i do jádra pronikat nukleová kyselina. Lineární DNA s volnými konci je rekombinogennější a je pravděpodobnější, že bude integrována do hostitelského chromozomu a vzniknou stabilní transformanti. Superzavinutá DNA se snáze balí do chromatinu a je obecně účinnější pro přechodnou genovou expresi.
Použití vysokonapěťových elektrických šoků k zavedení DNA do buněk poprvé provedli Wong a Neumann s použitím fibroblastů (Wong a Neumann, 1982; Neumann a kol., 1982). Poté byla tato technika zobecněna (Potter a kol., 1984) na všechny typy buněk – dokonce i na ty, jako jsou lymfocyty, které na rozdíl od fibroblastů nelze transfekovat jinými postupy (např, fosforečnan vápenatý nebo DEAE-dextranové koprecipitáty DNA).
Oliver Smithies a jeho kolegové poté použili elektroporaci k zavedení DNA do embryonálních kmenových buněk (ES) a navrhli cílené vektory, které umožnily, aby se zavedená DNA rekombinovala s homologními oblastmi v genomu a zavedla buď změněný gen, nebo rušivou sekvenci, čímž vznikly ES buňky s konkrétním genem „knocked in“ nebo „knocked out“. Změněné ES buňky pak byly použity k vytvoření odpovídajících knockin nebo knockout myší. Elektroporace byla pro tyto aplikace přenosu genů nezbytná, protože zavádí DNA do buněk v holé formě, která se může snadno účastnit homologní rekombinace. Toto rozšíření elektroporace vedlo Dr. Smithiese ke sdílení Nobelovy ceny za medicínu nebo fyziologii v roce 2007. Metodika elektroporace ES buněk je v podstatě stejná jako u jiných savčích buněk. Pokud je požadována homologní genová náhrada, je třeba navrhnout vektory, které umožňují „pozitivně-negativní“ selekci (Bronson a Smithies, 1994; Joyner 2000) tak, aby se při jedné selekci obnovily všechny buňky, do jejichž genomu se elektroporaněná DNA vložila, a druhá selekce byla zaměřena proti klonům ES, do nichž se DNA vložila náhodně. Knockin/out myši pak mohou být vytvořeny spojením vybraných klonovaných ES buněk s embryi, reimplantací, která umožní vývoj, a šlechtěním vzniklých chimér, aby se vytvořily myši, v nichž všechny buňky nesou změněný gen.
Ačkoli bylo zaznamenáno, že celé rostliny nebo listová tkáň jsou transfektovatelné elektroporací, rostlinné buňky musí být obvykle vytvořeny do protoplastů, aby do nich mohla být DNA snadno vnesena (alternativní protokol; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Stejně jako savčí buňky mohou být rostlinné protoplasty elektroporovány za různých elektrických podmínek (kritických parametrů). K dosažení úspěšného přenosu genů bylo použito jak vysoké napětí s nízkou kapacitou (krátké trvání pulzu), tak nízké napětí s vysokou kapacitou (dlouhé trvání pulzu) (Chu et al., 1991). In vivo EP byl původně využíván k přenosu chemoterapeutických látek do solidních nádorů a postupoval od preklinických studií až ke klinickým zkouškám (Gothelf, et al., 2003). Dodání plasmidové DNA in vivo pomocí elektroporace bylo poprvé popsáno na začátku až v polovině 90. let 20. století (Titomarov a kol., 1991; Heller a kol., 1996; Nishi a kol., 1996) a bylo logickým pokrokem založeným na úspěchu in vitro transfekcí pomocí elektroporace a na prokázání, že tento postup lze bezpečně provádět in vivo při dodávání malých molekul, jako jsou chemoterapeutika. Použití elektroporace in vivo pro dodávání plasmidové DNA zaznamenalo obrovský nárůst počtu prováděných preklinických studií a nedávno bylo převedeno do klinické praxe (Heller, et al., 2006a a Bodles-Brakhop, et al.,2009).
Široké využití elektroporace bylo z velké části umožněno dostupností komerčních přístrojů, které jsou bezpečné a snadno použitelné a které poskytují mimořádně reprodukovatelné výsledky. Konstrukce těchto přístrojů se značně liší, ale dělí se do dvou základních kategorií, které využívají různé způsoby řízení délky pulzu a napětí (dva elektrické parametry, které řídí tvorbu pórů). Jeden typ používá kondenzátorový vybíjecí systém pro generování exponenciálně klesajícího proudového impulsu a druhý generuje skutečnou čtvercovou vlnu (nebo její aproximaci). Přístroje s kondenzátorovým výbojem nabíjejí svůj vnitřní kondenzátor na určité napětí a poté jej vybíjejí přes suspenzi buněk a DNA. Velikost kondenzátoru i napětí lze měnit. Protože proudový impulz je exponenciálně se rozkládající funkcí (1) počátečního napětí, (2) nastavení kapacity přístroje a (3) odporu obvodu (včetně vzorku), změna velikosti kondenzátoru tak, aby se při daném napětí uložilo více (nebo méně) náboje, bude mít za následek delší (nebo kratší) dobu rozpadu, a tudíž jinou efektivní dobu trvání impulzu. Naproti tomu generátory čtvercových vln řídí jak napětí, tak dobu trvání pulzu pomocí polovodičových spínacích zařízení. Mohou také vytvářet rychle se opakující impulsy. Pro aplikace in vivo se dává přednost generátorům čtvercových vln. Kromě délky trvání a amplitudy pulzů ovlivňuje účinnost dodávky také počet pulzů a konfigurace elektrod.
Většina našich experimentů s elektroporací in vitro používala zařízení Bio-Rad Gene Pulser, což je kondenzátorový výboj, ale jsou přímo použitelné i pro jiná zařízení s kondenzátorovým výbojem a s určitou úpravou i pro generátory čtvercových vln. Kondenzátorová vybíjecí zařízení jsou k dispozici také od společností GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific a International Biotechnologies (adresy dodavatelů viz PŘÍLOHA 4). Tato zařízení, ať už v jedné jednotce, nebo prostřednictvím přídavných komponent, mohou poskytovat různé podmínky elektroporace vhodné pro většinu aplikací. Generátory čtvercových vln jsou k dispozici od společností BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan a IGEA a nabízejí velkou kontrolu nad šířkou pulzu, umožňují více rychlých pulzů a mohou být účinnější pro buňky, které jsou velmi citlivé nebo jinak obtížně transfekovatelné. Použití elektroporace k provedení genové terapie u živých zvířat nebo lidí rovněž vyžaduje dobrou kontrolu parametrů elektroporace, aby byl zajištěn účinný přenos DNA s minimálním poškozením tkáně, a to obvykle vyžaduje generátory se čtvercovými vlnami. K dispozici jsou generátory pro podávání pulzů buď s konstantním napětím, nebo s konstantním proudem. Kromě generátorů se čtvercovými vlnami jsou od těchto dodavatelů k dispozici také elektrody vhodné pro elektroporaci in vivo. Tato zařízení jsou obecně dražší. Ukázalo se, že pulzy střídavého proudu o frekvenci ~100 kHz mohou být nejúčinnější formou vlny pro elektroporaci a případně elektrofúzi (Chang, 1989).
Většina našich in vivo experimentů využívala generátory čtvercových vln BTX T820 nebo T830. Při těchto experimentech byly použity komerčně dostupné elektrody, jako je soustava dvou jehel, třmenové elektrody a klešťové elektrody, a také elektrody navržené na míru. Jak bylo uvedeno výše, hlavní dodavatelé elektroporačního zařízení mají k dispozici různé penetrační a nepenetrační elektrody. Generátory se čtvercovou vlnou umožňují lepší kontrolu parametrů pulzů, což je důležité zejména při podávání in vivo. Růst používání elektroporace in vivo přímo souvisí s jejím účinným podáním do svalu . Aplikace intramuskulárního doručování genů pomocí elektroporace má význam zejména pro účely vakcinace (Abdulhagg, et al., 2008). Bylo také prokázáno, že sval je vynikajícím depem pro aplikace náhrady proteinů na bázi genů (Trollet, et al., 2006). Dodání do svalu lze také využít pro dodání protinádorových vakcín (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Dodávka do kůže se rovněž prosadila jako univerzální cíl. Dodání do kůže lze použít k přímé léčbě kožních onemocnění, k dodání proteinů do oběhu pro systémovou léčbu, k léčbě rakoviny a k dodání DNA vakcín (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Elektroporace může být jednodušší na provedení než alternativní techniky, a proto se stále více využívá. Její nevýhodou pro použití při tranzientní analýze je, že je zapotřebí téměř pětkrát více buněk a DNA než při transfekci zprostředkované fosforečnanem vápenatým nebo DEAE-dextranem (JEDNOTKY 9.1, 9.2 & 16.12). Hlavním rozdílem mezi postupy elektroporace a koprecipitace fosforečnanem vápenatým je stav integrované DNA po selekci ve vhodných antibiotických médiích. V případě fosforečnanu vápenatého se množství DNA přijaté a integrované do genomu každé transfekované buňky pohybuje v rozmezí 3 × 106 bp. V důsledku toho se transfekovaná DNA často integruje jako velká tandemová pole obsahující mnoho kopií transfekované DNA. To by bylo výhodou v případě, kdy je požadována transfekce genomové DNA do buněk příjemce a selekce na určitou fenotypovou změnu, jako je maligní transformace; zde je nezbytné velké množství DNA integrované na buňku příjemce. Naproti tomu elektroporace může být upravena tak, aby výsledkem byla jedna až mnoho kopií vložené DNA na jednu buňku příjemce. To by bylo výhodou pro studie genové exprese, protože lze kontrolovat identitu konkrétní kopie zodpovědné za expresi genu, a jak je uvedeno výše, je to nezbytné pro cílení genů na ES buňky za účelem vytvoření transgenních myší.
.