Infekce Giardia lamblia je jednou z nejčastějších příčin průjmových onemocnění na celém světě (22). Tento protozoární patogen kolonizuje tenké střevo a může se přichytit na epitel, ale nenapadá sliznici. Infekce obvykle probíhají samovolně, protože imunokompetentní hostitelé mohou G. lamblia kontrolovat a obvykle eradikovat, což je proces, který zahrnuje CD4 T buňky a tvorbu sekrečního imunoglobulinu A (IgA) a dalších, málo známých efektorů (6, 8, 9, 18). Navzdory často závažným klinickým příznakům, průjmům, bolestem břicha, malabsorpci a hubnutí, není infekce doprovázena významným zánětem sliznic (12). Tato pozorování naznačují, že mediátory zánětu nemusí být pro průjem vyvolaný parazitem důležité, ačkoli mechanismy řídící průjem u giardiózy nejsou dostatečně známy. Nebylo prokázáno, že by giardie uvolňovaly enterotoxiny, které by mohly být příčinou poruchy vstřebávání nebo vylučování střevní tekutiny. Při infekci giardiemi u myší dochází ke snížení absorpčního povrchu v důsledku ztráty epitelových mikrovilů (16), což by mohlo vést k osmoticky podmíněnému průjmu spojenému s malabsorpcí, ale absolutní snížení povrchu je ve srovnání s předpokládanou anatomickou rezervou tenkého střeva skromné. Lidé infikovaní G. lamblia vykazují při radiologickém vyšetření známky střevní hypermotility (15), což je jev pozorovaný také u experimentálně infikovaných pískomilů mongolských (5). Základní mechanismy a funkční význam těchto nálezů jsou v současné době nejasné. Cílem této studie proto bylo ověřit hypotézu, že střevní hypermotilita představuje obranný mechanismus hostitele proti giardióze, pomocí myších modelů giardiózy.

Dospělé myši C57BL/6, SCID a myši s deficitem neuronální syntázy oxidu dusnatého (nNOS) byly získány od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pro infekci Giardia muris byly cysty přečištěny sacharosovou flotací, spočítány na hemocytometru pod mikroskopem s fázovým kontrastem a podány perorálním podáním ve vodě v množství 104 cyst/myš v 0,2 ml (9). Pro infekci G. lamblia byli trofozoiti kmene GS/M (ATCC 50580) (11) kultivováni v médiu TYIS-33 a podáváni perorálně v množství 107 cyst/myš v 0,2 ml téhož média (9). Motilita tenkého střeva byla stanovena modifikovanou metodou testovacího pokrmu. Myši byly přes noc nalačno a bylo jim podáno 0,2 ml suspenze 106 fluorescenčních polystyrenových kuliček (karboxylátové mikrosféry Fluoresbrite YG o průměru 10 μm; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) a 6 % karmínového barviva v 5 % arabské gumě ve fosfátovém pufrovaném roztoku (PBS). Po 20 minutách bylo tenké střevo rychle vyjmuto a byla zaznamenána poloha čela karmínového barviva a celá délka tenkého střeva. Střevo bylo poté rozděleno na osm stejně velkých kusů, z nichž každý byl podélně otevřen, vložen do 2 ml PBS a 10 min chlazen na ledu. Směs byla silně protřepána, aby se oddělily trofozoity a kuličky, které byly poté spočítány zvlášť pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem a fluorescenčního mikroskopu. Vzdálenost uražená frontou karmínového barviva byla vyjádřena v procentech celé délky tenkého střeva. Počet kuliček na segment byl vyjádřen jako procento z celkového počtu kuliček v tenkém střevě. Pro posouzení důsledků inhibice motility tenkého střeva na clearance giardu byly myši nejprve perorálně infikovány G. muris nebo G. lamblia GS/M a každý druhý den, počínaje 7. dnem nebo 4. dnem, jim bylo perorálně podáváno 30 mg/kg loperamidu nebo PBS jako kontrola. Počet malých střevních trofozoitů byl stanoven 21. den pro G. muris a 9. den pro G. lamblia.

Abychom zjistili, zda jsou normální dospělé myši vhodným modelem pro studium úlohy střevní motility při kontrole giardiální infekce, infikovali jsme 8 až 10 týdnů staré myši C57BL/6 cystami přirozeně se vyskytujícího myšího patogenu G. muris. Motilita tenkého střeva byla stanovena metodou testovací moučky s použitím karmínového barviva jako markeru tekuté fáze (14) a 10 μm polystyrenových kuliček jako markeru částic srovnatelných s velikostí trofozoitů giardií (19). Infekce G. muris urychlila tranzit tenkým střevem, protože fronty karmínového barviva (obr. (obr. 1A)1A) i polystyrenových kuliček (obr. (obr. 1B)1B) urazily u infikovaných myší výrazně větší vzdálenost než u neinfikovaných kontrol. Analýza časového průběhu tohoto jevu odhalila, že hypermotilita se objevila během týdne po infekci, ale vrcholu dosáhla ve 2. až 3. týdnu, tedy v době, kdy byl počet trofozoitů nižší ve srovnání s počtem v době maximální infekce v 1. týdnu (obr. (Obr.1A)1A). Maximální změny v motilitě tenkého střeva byly tedy opožděny vzhledem k vrcholu zátěže trofozoity, což naznačuje, že tyto změny mohou být způsobeny jiným mechanismem než přímou giardiální stimulací.

Toto zjištění připomíná zprávy o ztrátě střevních epiteliálních mikrovilů způsobené giardiemi, u kterých byla zjištěna odpovědnost adaptivní imunitní odpovědi hostitele (16, 17). Abychom zhodnotili, zda se podobné mechanismy mohou podílet na vzniku hypermotility tenkého střeva, hodnotili jsme myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID myši). Tyto myši postrádají funkční T a B buňky v důsledku defektu katalytické podjednotky DNA-dependentní proteinkinázy PRKDC, která je nezbytná pro normální V(D)J rekombinaci, a nemohou eradikovat giardie (9, 18). Infekce SCID myší G. muris nezměnila tranzit tenkým střevem, což ostře kontrastovalo s pozorováním u imunokompetentních kontrol (obr. (obr. 2).2). Tyto výsledky naznačují, že hypermotilita tenkého střeva spojená s giardiózou byla závislá na indukci normální adaptivní imunitní odpovědi na patogen.

Pro testování, zda pozorovaná hypermotilita tenkého střeva přispěla ke clearance giardií, jsme myším podávali loperamid, lék, který inhibuje střevní tranzit aktivací μ-opioidních receptorů v gastrointestinálním traktu (2, 13, 21). Léčba lékem byla zahájena v době vrcholu infekce G. muris (7. den), aby se zajistilo, že farmakologicky vyvolané změny motility nebudou zasahovat do počátečního vzniku infekce. Inhibice motility tenkého střeva loperamidem výrazně zhoršila giardiální clearance, přičemž počet trofozoitů u myší léčených loperamidem byl po 21 dnech 25krát vyšší než u kontrol léčených PBS (obr. (obr. 3).3). Léčba loperamidem neměla žádný vliv na vývoj adaptivní imunity, protože titry antigiardiálního IgA ve střevním slizničním sekretu nebyly léčbou ovlivněny (údaje nejsou uvedeny). Tato experimentální strategie navíc odhalila podobný inhibiční účinek na myší infekci G. lamblia GS/M, lidským giardiálním patogenem, který může infikovat normální dospělé myši (3, 9). Myši léčené PBS se do 9 dnů infekce z velké části zbavily, zatímco myši léčené loperamidem od 4. dne měly v tenkém střevě i nadále významný počet trofozoitů G. lamblia (obr. (obr. 3).3). Inhibice motility tenkého střeva tedy narušila clearance giardií u myšího hostitele bez ohledu na druh giardie. Jako další přístup k určení významu střevní motility v antigiardiální obraně hostitele jsme použili genetický přístup, při kterém narušení genu pro nNOS narušuje účinnou propulzi ve střevě u myší (20). Analýza motility potvrdila, že nNOS deficientní myši vykazovaly konstitutivní zpoždění střevního tranzitu ve srovnání s jejich divokým typem (obr. (obr. 4A).4A). Současně knockoutované myši nedokázaly normálně odstranit infekci G. lamblia (obr. (obr. 4B).4B). Pomocí farmakologických a genetických přístupů jsme tedy zjistili, že snížená střevní motilita je spojena s narušením obrany hostitele proti giardiím.

Naše studie ukazuje, že střevní hypermotilita je důležitou obranou hostitele proti Giardii, což je závěr, ke kterému dospěla i jiná nedávná zpráva (10). Zdá se, že tato obrana závisí na rozvoji normální adaptivní imunitní odpovědi proti parazitovi, protože se nevyskytla u myší s nedostatkem T a B buněk, i když je v zásadě možné, že T nebo B buňky přispívají k hypermotilitě nezávisle na své roli v adaptivní antigiardiální imunitě. Hypermotilita závislá na imunitě funguje v obraně hostitele proti jiným střevním parazitům, zejména helmintům. Například eradikace škrkavky Trichinella spiralis, která tráví významnou část svého životního cyklu v tenkém střevě, je vysoce korelována se zvýšenou střevní motilitou (4, 23). Podobně je vypuzení měchovce Nippostrongylus brasiliensis u potkanů doprovázeno hypermotilitou tenkého střeva, což naznačuje roli v obraně hostitele proti tomuto helmintovi (7). Společným znakem všech těchto střevních patogenů je jejich primární, ne-li výlučná lokalizace ve střevním lumen. Z anatomického hlediska se toto místo infekce nachází mimo vlastní tělo vystlané epitelem, a proto není snadno přístupné mnoha imunitním efektorovým buňkám a molekulám, jako jsou neutrofily nebo komplement, které účinně působí uvnitř těla. Ve skutečnosti představuje účinná antimikrobiální obrana ve střevním lumen zvláštní výzvu pro hostitele, který má na tomto místě omezený repertoár obranných prostředků. Z nich je sekreční IgA běžně považován za hlavní luminální obranný mechanismus, ale jeho skutečný význam v giardiální clearance se zdá být různý a může záviset na špatně definovaných faktorech hostitele a parazita (6, 9, 18). Naše údaje a předchozí práce s helminty (4, 23) naznačují, že střevní hypermotilita je dalším důležitým obranným mechanismem proti kolonizaci střevního lumen.

Hermotilita závislá na imunitním systému může poskytnout mechanistické vysvětlení průjmu spojeného s giardiózou, jak bylo uvedeno v předchozích zprávách (5, 15). V zásadě může být průjem způsoben sníženou absorpcí tekutin nebo zvýšenou sekrecí nebo kombinací těchto dvou mechanismů. Pro zvýšenou sekreci iontů a tekutin u giardiózy existuje jen málo důkazů, takže pravděpodobnou příčinou je zhoršená absorpce tekutin. Očekává se, že zkrácená doba kontaktu s luminálními tekutinami, které mohou být požité nebo pocházející ze žaludečního nebo pankreatického sekretu, ohrozí účinnost transportu iontů přes epitel, zejména pokud se hypermotilita kombinuje s uváděnou ztrátou absorpčních povrchů epitelu (16). Je však třeba poznamenat, že myši při infekci giardiemi nevykazují otevřený průjem. Nicméně je možné, že k nerovnováze střevních tekutin dochází jak u lidských, tak u zvířecích hostitelů a že zůstává kompenzována u myší, ale ne u lidí. Pokud hypermotilita skutečně přispívá k patogenezi průjmu, naše zjištění, že SCID myši nevykazují hypermotilitu vyvolanou giardiemi, by znamenalo, že u pacientů s buněčnými imunodeficity spojenými se zvýšenou vnímavostí k infekcím giardiemi (např. chronická variabilní imunodeficience) může být méně pravděpodobné, že se u nich vyvine průjem spojený s infekcí. Naše výsledky navíc naznačují, že při zvažování použití inhibitorů střevní motility při léčbě průjmu vyvolaného giardiemi je třeba postupovat opatrně (1), protože taková léčba může prodloužit základní infekci.

.