FRAP lze použít také ke sledování proteinů mimo membránu. Poté, co se protein, který je předmětem zájmu, stane fluorescenčním, obvykle expresí jako fúzní protein GFP, použije se konfokální mikroskop k fotobleachingu a sledování oblasti cytoplazmy, mitotického vřeténka, jádra nebo jiné buněčné struktury. Průměrná fluorescence v oblasti může být poté vynesena do grafu v závislosti na čase od fotobleaku a výsledná křivka může poskytnout kinetické koeficienty, jako jsou koeficienty pro vazebné reakce proteinu a/nebo koeficient difúze proteinu v prostředí, kde je sledován. Často se uvažuje pouze o dynamice difúze a vazebných/odvazebných interakcích, avšak v zásadě se proteiny mohou pohybovat také prostřednictvím toku, tj, To může být způsobeno prouděním cytoplazmy nebo nukleoplazmy nebo transportem podél filament v buňce, jako jsou mikrotubuly, pomocí molekulárních motorů.

Analýza je nejjednodušší, když je obnovení fluorescence omezeno buď rychlostí difuze do vybělené oblasti, nebo rychlostí, kterou se vybělené proteiny odvazují ze svých vazebných míst uvnitř vybělené oblasti a jsou nahrazeny fluorescenčním proteinem. Podívejme se na tato dvě omezení pro běžný případ bělení fúzního proteinu GFP v živé buňce.

Difuzí omezená obnova fluorescenceEdit

Pro kruhové bělící místo o poloměru w {\displaystyle w}.

a difuzně omezeném zotavení je fluorescence popsána rovnicí odvozenou Soumpasisem (která zahrnuje modifikované Besselovy funkce I 0 {\displaystyle I_{0}}.

a I 1 {\displaystyle I_{1}}.

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

s τ D {\displaystyle \tau _{D}}

charakteristická časová stupnice pro difúzi a t {\displaystyle t}

je čas. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

je normalizovaná fluorescence (přechází na 1, když t {\displaystyle t}

jde do nekonečna). Difuzní časová stupnice pro vybělenou skvrnu o poloměru w {\displaystyle w}

je τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, přičemž D je koeficient difúze.

Všimněte si, že se jedná o okamžité bělení s profilem skokové funkce, tj. zlomek f b {\displaystyle f_{b}}.

bílkoviny, o níž se předpokládá, že se bělí okamžitě v čase t = 0 {\displaystyle t=0}.

je f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, a f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, pro r {\displaystyle r}

je vzdálenost od středu vybělené oblasti. Předpokládá se rovněž, že obnovu lze modelovat dvourozměrnou difuzí, která je rovněž rovnoměrná a izotropní. Jinými slovy, že difúze probíhá v homogenním prostředí, takže efektivní difúzní konstanta D je všude stejná, a že difúze je izotropní, tj. probíhá stejnou rychlostí podél všech os v rovině.

V praxi nebude v buňce žádný z těchto předpokladů striktně platit.

1. Vyloučení nebude okamžité. Zejména pokud je vyžadováno silné vybělení velké plochy, může vybělení trvat značnou část časové stupnice difuze τ D {\displaystyle \tau _{D}}.
   

   . Pak bude významná část vyběleného proteinu difundovat mimo vybělenou oblast skutečně během bělení. Nezohlednění této skutečnosti vnese do D značnou chybu.

2. Vybělený profil nebude radiální skokovou funkcí. Pokud je bělené místo ve skutečnosti jediný pixel, pak bude bělení jako funkce polohy obvykle difrakčně omezené a určené optikou použitého konfokálního laserového skenovacího mikroskopu. Nejedná se o radiální skokovou funkci a mění se také podél osy kolmé k rovině.
3. Buňky jsou samozřejmě trojrozměrné, nikoli dvourozměrné, stejně jako vybělený objem. Zanedbání difúze mimo rovinu (bereme ji jako rovinu xy) bude rozumnou aproximací pouze tehdy, pokud se fluorescence obnovuje převážně difúzí v této rovině. To bude platit například v případě, že se bělí válcový objem s osou válce podél osy z a s tímto válcovým objemem procházejícím celou výškou buňky. Pak difúze podél osy z nezpůsobuje obnovení fluorescence, protože všechny bílkoviny jsou vyběleny rovnoměrně podél osy z, a proto je její zanedbání, jak to činí Soumpasisova rovnice, neškodné. Pokud však difúze podél osy z přispívá k obnově fluorescence, je třeba ji zohlednit.
4. Není žádný důvod očekávat, že buněčná cytoplazma nebo nukleoplazma budou zcela prostorově homogenní nebo izotropní.

Takže Soumpasova rovnice je pouze užitečná aproximace, kterou lze použít, pokud jsou výše uvedené předpoklady dobrými aproximacemi skutečné situace a pokud je obnova fluorescence skutečně omezena časovou škálou difuze τ D {\displaystyle \tau _{D}}.

. Všimněte si, že to, že Soumpasis lze adekvátně přizpůsobit datům, nemusí nutně znamenat, že předpoklady jsou pravdivé a že difúze dominuje obnově.

Zotavení omezené reakcíUpravit

Rovnice popisující fluorescenci jako funkci času je zvláště jednoduchá v jiné limitě. Jestliže se velký počet proteinů váže na místa v malém objemu tak, že tam fluorescenčnímu signálu dominuje signál z navázaných proteinů, a jestliže je tato vazba všechna v jediném stavu s rychlostí vypnutí koff, pak je fluorescence jako funkce času dána vztahem

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{off}}t}}}

Všimněte si, že obnovení závisí pouze na rychlostní konstantě pro rozvázání, koff. Nezávisí na rychlosti vázání. I když závisí na řadě předpokladů

1. Rychlost zapnutí musí být dostatečně velká, aby lokální koncentrace vázaného proteinu výrazně převyšovala lokální koncentraci volného proteinu, a tak nám umožňuje zanedbat příspěvek k f volného proteinu.
2. Reakce je jednoduchá bimolekulární reakce, při níž se protein váže na lokalizovaná místa, která se během zotavení výrazně nepohybují
3. Výměna je mnohem pomalejší než difúze (nebo jakýkoli transportní mechanismus, který je zodpovědný za pohyblivost), protože pouze tehdy se difundující frakce rychle zotavuje a pak působí jako zdroj fluorescenčního proteinu, který se váže a nahrazuje vázaný vybělený protein, a tak zvyšuje fluorescenci. S r jako poloměrem vybělené skvrny to znamená, že rovnice platí pouze v případě, že doba života vázaného 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Jsou-li všechny tyto předpoklady splněny, pak dosazením exponenciály na křivku obnovy získáme konstantu rychlosti vypnutí, koff. Jiné dynamiky však mohou dávat křivky zotavení podobné exponenciálám, takže dosazení exponenciály nemusí nutně znamenat, že zotavení je ovládáno jednoduchou bimolekulární reakcí. Jedním ze způsobů, jak rozlišit mezi obnovou, jejíž rychlost je dána nevázaností, a obnovou, která je omezena difuzí, je poznamenat, že rychlost obnovy pro obnovu omezenou nevázaností je nezávislá na velikosti vybělené oblasti r, zatímco se škáluje jako r – 2 {\displaystyle r^{-2}}.

, pro obnovu omezenou difuzí. Pokud je tedy vybělena malá a velká plocha, pak pokud je obnova omezena nevázaností, bude rychlost obnovy pro obě velikosti vybělené plochy stejná, zatímco pokud je obnova omezena difuzí, bude pro větší vybělenou plochu mnohem pomalejší.

Difúze a reakceEdit

Všeobecně platí, že obnově fluorescence nebude dominovat ani jednoduchá izotropní difúze, ani jediná jednoduchá rychlost odvázání. Bude docházet jak k difúzi, tak k vazbě, a skutečně difúzní konstanta nemusí být v prostoru rovnoměrná a může existovat více než jeden typ vazebných míst a tato místa mohou mít také nerovnoměrné rozložení v prostoru. Důležité mohou být také tokové procesy. Toto složitější chování znamená, že k popisu dat je zapotřebí model s několika parametry; modely pouze s jedinou difuzní konstantou D nebo jedinou konstantou vypínací rychlosti, koff, jsou nedostatečné.

Existují modely s difuzí i reakcí. Bohužel jediná křivka FRAP nemusí poskytnout dostatečný důkaz, aby spolehlivě a jednoznačně odpovídala (případně zašuměným) experimentálním datům. Sadegh Zadeh a kol. ukázali, že křivky FRAP lze přizpůsobit různým dvojicím hodnot difuzní konstanty a konstanty on-rate, nebo jinými slovy, že přizpůsobení FRAP nejsou jedinečná. Jedná se o tříparametrové (on-rate konstanta, off-rate konstanta a difúzní konstanta) fitování. Přizpůsobení, která nejsou jedinečná, nejsou obecně užitečná.

Pro modely s řadou parametrů může být jeden experiment FRAP nedostatečný pro odhad všech parametrů modelu. Pak je zapotřebí více údajů, např. vybělením různě velkých oblastí, nezávislým určením některých parametrů modelu atd.

.