Objev triterpenoidů Ganoderma lucidum jako potenciálních inhibitorů proti NS2B-NS3 proteáze viru Dengue

NS2B-NS3 proteáza
Virtuální screening a simulační analýza dokování
Molekulární interakce a MM/GBSA analýza
Analýza molekulární dynamiky (MD)

NS2B-NS3 proteáza

Třírozměrná struktura (3D) cílového proteinu byla stanovena jako základní požadavek pro objevování léčiv. K identifikaci potenciálních ligandů z chemických databází byly použity jak rentgenové krystalografické struktury, tak homologické modely vytvořené pro cílové proteiny, ale bylo doloženo, že 3D krystalografické struktury jsou účinnější než homologické modely vytvořené in silico. Proto byla 3D struktura proteázy NS2B-NS3 DENV, která byla navržena jako hlavní terapeutický cíl proti infekci DENV, získána z banky proteinových dat (PDB) s ID PDB:2FOM40. Krystalová struktura NS2B-NS3pro byla rozlišena s rozlišením 1,5 Å a vykazovala dva proteinové řetězce, tj. řetězec A složený tak, aby tvořil kofaktor NS2B, a řetězec B zahrnující doménu NS3pro (obr. 2a). Zde byla proteázová doména (NS3pro) v řetězci B (obr. 2b) vybrána pro virtuální screening založený na struktuře s vybranými triterpenoidy z G. lucidum.

Virtuální screening a simulační analýza dokování

V poslední době si virtuální screening založený na struktuře získal popularitu pro objevování nových hlavních sloučenin z velkých bioaktivních chemických knihoven proti vybraným cílům. Tento přístup zahrnuje simulované dokování ligandů v oblasti aktivního místa vybraného receptoru s následným seřazením a bodováním inhibitorů23. V této práci jsme provedli virtuální screening založený na struktuře 22 známých antivirových triterpenoidů z G. lucidum proti NS3pro pomocí modulu Glide sady Schrodinger (tab. S1). Tyto inhibitory byly dále analyzovány pomocí dokovacího protokolu XP modulu Glide s cílem získat informace o vazebné energii a také další vazebné vzorce se zbytky aktivního místa. Bylo zjištěno, že všechny vybrané triterpenoidy vykazovaly významné vazebné afinity vůči NS2B-NS3pro s výjimkou kyseliny ganoderové G (tabulka S1). Také molekulární dokování referenčního inhibitoru 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrachinonu proti stejnému aktivnímu místu poskytlo dokovací skóre -5,377 kcal/mol. Proto byly pro analýzu molekulární interakce vybrány triterpenoidy s dokovacím skóre lepším než prahová hodnota -5 kcal/mol. Jako možné inhibitory pro NS3pro doménu proteázy DENV jsme vybrali celkem čtyři triterpenoidy, tj. ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), lucidumol A (-5,993 kcal/mol), kyselinu ganoderovou C2 (-5,948 kcal/mol) a kyselinu ganosporerovou A (-5,830 kcal/mol). Tato dokovací skóre byla považována za významná ve srovnání se známým inhibitorem 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrachinonem (-5,377 kcal/mol) a uváděnými bioaktivními molekulami nimbinem (-5,56 kcal/mol), desacetylnimbinem (-5,24 kcal/mol) a desacetylsalaninem (-3,43 kcal/mol) z Azadirachta indica s DENV NS3pro41. Tyto výsledky naznačují potenciál bioaktivních triterpenoidů z G. lucidum jako inhibitorů proteasy DENV a naznačují, že by mohly být využity při vývoji antivirových léčiv proti infekci DENV.

Molekulární interakce a MM/GBSA analýza

Protože molekulární kontakty v dokovaných komplexech protein-ligand mohou vést k lepšímu pochopení molekulárních mechanismů v biologických systémech42 , bylo pro vybrané triterpenoidy a referenční inhibitor s proteasou DENV studováno také profilování molekulárních kontaktů. Komplex NS3pro-Ganodermanontriol vykazoval interakce pomocí mírných jednoduchých a dvojitých vodíkových vazeb v aktivní oblasti se zbytky Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) a Asn167 (3,26 Å, resp. 2,86 Å). Další hydrofobní přitažlivosti byly zaznamenány také v komplexu NS3pro-Ganodermanontriol u zbytků Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 a Ala164. Také zbytky His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 a Gly153 vykazovaly polární, resp. glycinové interakce s ganodermanontriolem. Mezitím byly v dokovaném komplexu NS3pro-Ganodermanontriol zaznamenány také kladně (Lys73 a Lys74) a záporně nabité interakce (Asp75) se zbytky (obr. 3a,b).

Interakční profily NS3pro-Lucidumol A odrážely dvě jednoduché vodíkové vazby vytvořené se zbytky Asp75 (3,31 Å) a Asn152 (2,48 Å) a tvorbu dvojité vodíkové vazby u Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), která také přispívá k glycinové interakci se zbytkem Gly151. Kromě toho byly v dokovaném komplexu zaznamenány také hydrofobní (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 a Tyr161) a polární interakce (His51, Ser135 a Asn152). Asp75 vykazuje v aktivní kapse proteasy s Lucidumolem A interakce se záporným nábojem (obr. 3c,d). Také dokovaná kyselina ganoderová C2 v komplexu s NS3pro vykazovala mírnou tvorbu dvojitých vodíkových vazeb s Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å), zatímco tvorba jednoduchých vodíkových vazeb byla pozorována u zbytků Trp50 (2,66 Å) a Arg54 (1,93 Å). Kromě toho byla v tomto komplexu zaznamenána také tvorba solného můstku mezi hydroxylovou skupinou kyseliny ganoderové C2 a zbytkem Arg54 proteasy. Kromě toho byly v doku NS3pro-Ganoderic acid C2 zaznamenány také polární (zbytek His51 a Asn152), negativní (zbytek Asp75) a pozitivní (zbytek Arg54) interakce (obr. 3e,f). U dokovaného komplexu NS3pro-Ganosporerová kyselina A byly zjištěny tři jednoduché vodíkové vazby vytvořené na zbytcích Thr120, Asn152 a Asn167, zatímco Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 a Ala164 byly označeny jako vykazující hydrofobní interakce (obr. 3g,h). Dokovaná NS3pro s kyselinou ganosporerovou A navíc vykazovala polární (zbytky Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 a Asn167), pozitivní (Lys73 a Lys74) a negativně nabité interakce (Asp75).

Dále byl do aktivního místa proteázy NS3pro dokován referenční inhibitor, 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrachinon, a byly zaznamenány významné interakce. Tento komplex vykazuje tvorbu jednoduché vodíkové vazby na zbytku Phe130, zatímco u His51 byl zaznamenán solný můstek a pi-pi interakce s inhibitorem. Kromě toho byly v dokovaném komplexu zaznamenány také hydrofobní (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 a Tyr151), polární (His51, Ser131 a Ser135) a glycinové (Gly151 a Gly153) interakce.

Dospělo se k závěru, že všechny screeningované triterpenoidy vykazovaly vodíkovou vazbu s NS3pro na katalytické triádě (zbytek His51, Asp75 a Ser135) spolu s některými dalšími konzervovanými zbytky (Phe130, Tyr150, Asn152 a Gly153), u nichž byla zaznamenána významná úloha při vazbě substrátu pro DENV proteasu43,44 . Kromě toho byly zaznamenány i některé další zbytky, které sdílejí vodíkové vazby s různými ligandy. Tato pozorování naznačují, že vodíkové vazby mezi ligandem a jedním ze zbytků katalytické triády NS3pro mohou narušovat přenos elektronů mezi karboxylovou a imidazolovou skupinou zbytků Asp75 respektive His51. Bylo zjištěno, že takové narušení vede k abortivnímu nukleofilnímu útoku hydroxylové skupiny (ß-OH) zbytku Ser135, který je nezbytný pro zahájení proteolytické aktivity43,44 . Proto se dospělo k závěru, že screeningované triterpenoidy mohou vykazovat silnou afinitu k doméně NS3pro DENV prostřednictvím různých mezimolekulárních interakcí a naznačují, že by mohly působit jako léčiva proti infekci DENV prostřednictvím inhibice NS2B-NS3pro.

Dále byly dokované komplexy všech čtyř triterpenoidů, ganodermanontriolu, lucidumolu A, kyseliny ganoderové C2 a kyseliny ganosporerové A s NS3pro DENV analyzovány také pomocí MM/GBSA výpočtů pro výpočet vazebné afinity příslušných ligandů v aktivním místě. Tyto výpočty ukázaly relativně záporné hodnoty MM/GBSA pro všechny čtyři dokované komplexy, tj. NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganoderic acid C2 (-19.039 kcal/mol) a NS3pro-Ganosporerová kyselina A (-11,449 kcal/mol), zatímco referenční inhibiční komplex NS3pro-1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrachinon poskytl větší hodnotu (-38,934 kcal/mol). Tato pozorování naznačují, že inhibiční aktivita vybraných triterpenoidů vůči NS3pro by mohla být slabší než u referenčního inhibitoru, ale také naznačují, že silnější vazebná afinita ganodermanontriolu s NS3pro ve srovnání s ostatními triterpenoidy byla podpořena predikovaným dokovacím skóre. Kromě toho předpovězené hodnoty ΔG a fyzikálně-chemické složky, tedy ΔGBind Coulomb, ΔGBind kovalentní, ΔGBind vdW (van der Waalsovy síly), ΔGBind Solv SA (povrch přístupný rozpouštědlu) a ΔGBind Solv GB (zobecněná Bornova solvatační energie) analýzy pro vybrané triterpenoidy a pozitivní kontrolu komplexované s proteinem DENV NS3pro naznačují, že, v závislosti na ligandu ke stabilitě komplexů triterpenoidů a referenčních inhibitorů s proteinem DENV NS3pro nejvíce přispívá ΔGBind Coulomb a/nebo ΔGBind vdW. (obr. 4, S2, tab. S2). Proto byl ganodermanontriol uzavřen jako nejslibnější funkční triterpenoid pro protein DENV NS3pro a dále analyzován spolu s ostatními triterpenoidy pomocí molekulární dynamiky a in vitro analýzy.

Analýza molekulární dynamiky (MD)

Informace o interakci předpovězené z na cíl-ligand vypočtené pomocí přístupu molekulárního dokování lze dále ověřit pomocí simulace molekulární dynamiky a krystalografických studií38,41. Zde byla hodnocena stabilita vybraných komplexů triterpenoid-NS3pro domény pomocí 10 ns MD simulace z hlediska střední kvadratické odchylky (RMSD), střední kvadratické fluktuace (RMSF) a analýzy kontaktní mapy protein-ligand.

RMSD analýza C-alfa a páteřních atomů v komplexu DENV NS3pro se všemi čtyřmi ligandy ukázala stabilní a přijatelné odchylky během 10 ns MD simulace (obr. 5). Zajímavé je, že konečná fluktuace pro receptor byla zaznamenána jako <2 Å RMSD, zatímco inhibitor ganodermanontriol vykazoval stabilní a maximální odchylku 6 Å v komplexu s doménou NS3pro na konci simulačního intervalu (obr. 5a). Také RMSF vypočtené pro jednotlivá rezidua receptoru i atomy ligandu vykazovaly během simulačního intervalu přijatelné odchylky (méně než 2,8 Å) (obr. S3a, S4a). Nepatrné fluktuace RMSF však byly pozorovány i během časového intervalu 5 až 7 ns u keto a methylových skupin cyklopenta-fenanthren-7-onového kruhu ligandu (obr. S3a).

Podobně analýza RMSD pro komplex NS3pro-Lucidumol A odhalila, že jak receptor, tak ligand představovaly změny menší než 3 Å během intervalu 10 ns simulace (obr. 5b). Mezitím analýza RMSF pro NS3pro i Lucidumol A předpověděla odchylky <3 Å, přijatelné odchylky byly zaznamenány také u methylové a hydroxylové skupiny v heptanové oblasti ligandu během simulačního intervalu 10 ns (obr. S3b). Podobně ligand v komplexu NS3pro-Ganoderová kyselina C2 vykazoval přijatelné odchylky během počátečních 2-5 ns, po nichž následovala stabilita a konečná odchylka byla zaznamenána na úrovni méně než 8 Å během simulačního intervalu 10 ns (obr. S4b).

Komplex NS3pro-Ganoderová kyselina C2 také vykazoval nevýznamné odchylky v receptoru mezi 2-5 ns, po nichž následovala stabilita s konečnou odchylkou zaznamenanou na úrovni méně než 1,75 Å během simulačního intervalu (obr. 5c). Tyto přijatelné odchylky v ligandu (méně než 6 Å) a receptoru (3 Å) byly rovněž podpořeny vypočtenou RMSF pro příslušný komplex (obr. S3c, S4c).

Simulační analýza ligandu v dokovaném komplexu NS3pro-Ganosporerová kyselina A navíc vykazovala zpočátku nízkou odchylku po dobu 6 ns v karboxylové skupině umístěné na počáteční heptanové části ligandu, po níž následovalo získání stabilního stavu při RMSD 4,6 Å až do konce intervalu 10 ns (obr. 5d). Mezitím NS3pro vykazoval stabilní oscilace kolem 1,6 Å RMSD s nevýznamnými odchylkami v oblasti počátečního N terminálu (obr. 5d). Tato pozorování naznačují stabilitu příslušného dokovaného komplexu, což podporují křivky RMSF pro jednotlivá rezidua (méně než 3,5 Å), resp. atomy (3 Å) receptoru a ligandu (obr. S3d, S4d).

Z křivek simulačních trajektorií byla také vytvořena mapa interakcí mezi proteinem a ligandem popisující příspěvek jednotlivých reziduí k mezimolekulární vazbě (obr. 6). Mapa interakcí protein-ligand pro komplex NS3pro-Ganodermanontriol ukázala účast zbytků Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 a Asn167, které tvoří vodíkové vazby, hydrofobní přitažlivosti, iontové interakce a vodní můstky (obr. 6a). Zbytky Leu149 a Asn152 byly zvýrazněny, protože přispívaly k významným vodním můstkům a přitažlivým vodíkovým vazbám během simulačního intervalu 10 ns (obr. 6a). Reziduum Asn152 bylo rovněž předpovězeno pro tvorbu vodíkových vazeb v dokovacím komplexu (obr. 3a,b), což naznačuje význam tohoto rezidua v NS3pro pro interakci s ganodermanontriolem.

Mapa interakcí NS3pro-Lucidumol A zobrazovala účast His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 a Asn167 ve vodíkových vazbách, hydrofobních interakcích a vodních můstcích, přičemž největší podíl na tvorbě vodních můstků mají zbytky Asp75 a Gly153 (obr. 1). 6b). Molekulární dokovací analýza rovněž naznačila úlohu Gly153 ve vodíkových vazbách s ligandem (obr. 3c,d), což naznačuje význam tohoto zbytku pro stabilitu proteinu s ligandem. Kromě toho byl také indikován významný podíl zbytků Tyr161, Asp75 a Leu128 na interakcích s tímto ligandem zprostředkovaných vodou, vodíkovou vazbou a hydrofobními interakcemi (obr. 6b). Tyto výsledky naznačují, že Gly153, Tyr161, Asp75 a Leu128 jsou významně zodpovědné za stabilní konformaci komplexu NS3pro-Lucidumol A během simulačního intervalu.

Zatímco komplex NS3pro-Ganoderic acid C2 vykazoval příspěvky zbytků Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 a Tyr161 v různých molekulárních interakcích v mapování protein-ligand během simulace (obr. 6c). Je zajímavé, že k hlavní mezimolekulární interakci přispíval Arg54 tvorbou vodíkových vazeb následovaných vodními můstky a iontovou přitažlivostí (obr. 6c). Tento zbytek byl také v analýze molekulárního dokování předpovězen pro tvorbu dvou vodíkových vazeb s kyselinou ganoderovou C2 (obr. 3e,f), což naznačuje, že je klíčovým faktorem pro udržení stability cílového ligandu během simulace.

Také interakční profil NS3pro-Ganosporerová kyselina A ukázal, že zbytky Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 a Asn167 aktivně přispívají k vodním můstkům, hydrofobním a iontovým interakcím (obr. 3). 6d). Předpokládalo se však, že zbytky Lys73, Lys74, Val155 a Asn167 nejvíce přispívají ke stabilitě NS3pro komplexovaného s ligandem Ganosporeric acid A prostřednictvím vodíkových vazeb, následovaných vodními můstky, hydrofobními a iontovými interakcemi (obr. 6d). Také Asn167 byl v dokovaném komplexu označen za subjekt vykazující tvorbu vodíkové vazby s kyselinou Ganosporerovou A, což odhaluje jeho významný příspěvek ke stabilitě komplexu. Tyto výsledky potvrdily a naznačily významnou stabilitu jednotlivých triterpenoidů s doménou NS3pro proteázy DENV v dokovaných komplexech. Proto bylo opět navrženo, že by tyto triterpenoidy mohly být použity při přípravě léčiv proti infekci DENV.

Virtual world

NS2B-NS3 proteáza

Virtuální screening a simulační analýza dokování

Molekulární interakce a MM/GBSA analýza

Analýza molekulární dynamiky (MD)

Napsat komentář Zrušit odpověď na komentář

Nejnovější příspěvky