Sestavení genomu a anotace

Pro sestavení genomu H. medicinalis jsme získali DNA z dospělé pijavice. Před zpracováním byla pijavice udržována bez krmení po dobu nejméně 2 měsíců. Vytvořili jsme sadu tří shotgun knihoven pro provedení sekvenování pomocí tří různých platforem (doplňková tabulka 1). Všechny soubory přečtených dat byly spojeny a pomocí programu SPAdes byla vytvořena jediná sestava . Výsledná sestava obsahovala 168 624 kontigů s délkou kontigu N50 12,9 kb (doplňková tabulka 2).

Předběžná analýza (kontigy BlastN) odhalila přítomnost bakteriálních sekvencí ve výsledné sestavě. Proto jsme provedli binning k rozlišení kontigů pijavic (bin pijavic). Sestavili jsme rozdělení kontigů podle jejich GC abundance, četnosti tetranukleotidů a pokrytí čtení. Pro zvýšení přesnosti binningu bylo pokrytí čtení určeno kombinací čtení DNA se čteními odpovídajícími kombinovanému transkriptomu H. medicinalis (viz níže). Rozlišení eukaryotických a prokaryotických kontigů je znázorněno na obr. 1a/b, v doplňkové tabulce 3 a v doplňkových údajích 2. Kromě toho jsme vybrali mitochondriální kontigy k sestavení mitochondriálního genomu pijavice .

Eukaryotické kontigy prošly procedurou scaffoldingu pomocí párových čtení. Scaffoldy byly generovány pomocí datových sad párových čtení Illumina a párových čtení SSPACE . Po scaffoldingu se sestava skládala ze 14 042 sekvencí s délkou scaffoldu N50 98 kb (doplňkové tabulky 4 a 5). Délka genomu pijavice se odhaduje na 220-225 Mb. Celková délka sestaveného návrhu genomu je 187,5 Mbp, což odpovídá 85 % teoretické velikosti genomu pijavice (viz doplňková tabulka 6). Celkem bylo předpovězeno 14 596 genů kódujících proteiny.

Také jsme identifikovali nové homology genů kódujících známé antikoagulanty nebo proteiny související s krevní moučkou. Mnohonásobná zarovnání aminokyselin pro každou z těchto proteinových rodin (doplňkové obr. 1, 2) Na základě údajů o sekvenci genomu a s využitím sekvencí známých proteinů jsme určili organizaci těchto genů (doplňková tab. 7, obr. 1b). Pozice a délky exonů a intronů byly předpovězeny s využitím příslušných cDNA a proteinových sekvencí jako referencí. V některých případech jsou geny lokalizovány ve společných skeletech a tvoří tandemy nebo shluky Obr. 1b.

mRNA-seq, sestavení transkriptomu a anotace

Pro získání tkáňově specifických vzorků mRNA ze tří druhů pijavic lékařských, H. medicinalis, H. verbаna a H. orientalis, jsme izolovali slinné buňky a svaly z kryosekcí předních částí těla pomocí laserové mikrodisekce (obr. 2a). Poté jsme pro každý vzorek mRNA vytvořili dvě knihovny cDNA s normalizací a bez ní pomocí oligo-dT primeru a sekvenovali je na přístroji Ion Torrent PGM (Doplňková tabulka 8). Čtyři soubory dat čtení odpovídající zkonstruovaným knihovnám cDNA byly použity pro de novo sestavení kombinovaného transkriptomu pro každý druh pijavice lékařské pomocí sestavovače Trinity RNA (doplňková tabulka 9). Kombinované transkriptomy jsme použili k mapování nenormalizovaných tkáňově specifických čtení. Mapování čtení bylo nezbytné k provedení postupné analýzy diferenciální exprese.

Analýza genové ontologie (GO) detekovaných transkriptů byla provedena pomocí Blast2GO a BlastX. Jako referenční databáze sloužila databáze „nr“. Analýza GO ukázala, že všechny tři druhy pijavic lékařských měly podobné rozložení transkriptů v jednotlivých kategoriích GO (doplňkový obrázek 3). Podobná byla i taxonomická distribuce nejbližších shod v databázi BlastX (doplňkový obrázek 4). Bylo zjištěno, že většina identifikovaných transkriptů odpovídá dvěma druhům rodu Annelida: H. robusta 59,8 % a C. teleta 10,7 %. Tato analýza také potvrdila absenci kontaminace transkripty, které nejsou z pijavic.

Předpověď kódujících oblastí (neboli otevřených čtecích rámců, ORF) a anotace transkriptomických dat byla provedena pomocí programů Transdecoder a Trinotate. ORF byly přeloženy pomocí algoritmu BlastP a proteinové sekvence byly anotovány pomocí klasifikace EuKaryotic Orthologous Groups (KOG) s využitím databáze eggNOG (doplňkový obrázek 5). Klasifikace KOG odhalila, že všechny tři druhy pijavic lékařských mají podobné rozložení transkriptů napříč kategoriemi KOG. Bylo také zjištěno, že všechny tři druhy pijavic lékařských sdílejí naprostou většinu svých ortologických skupin (doplňkový obrázek 6).

Analýza diferenciální exprese

Pro odhad relativních úrovní exprese transkriptů identifikovaných ve slinných buňkách a svalech a pro identifikaci transkriptů jedinečných pro slinné buňky jsme mapovali tkáňově specifická čtení cDNA bez normalizace oproti kombinovanému transkriptomu jednotlivých druhů pijavic lékařských. Mapovali jsme také tkáňově specifická čtení cDNA H. medicinalis proti jejímu genomu. Diferenciálně exprimované geny byly detekovány podle nedávného protokolu . Pro identifikaci genů, které jsou diferenciálně exprimovány ve slinných buňkách a svalech, byl pro každý druh pijavky lékařské sestrojen individuální MA graf s využitím jejího kombinovaného transkriptomu (obr. 2b, doplňkový obrázek 7). Další MA graf byl sestrojen pro H. medicinalis s využitím jeho sestaveného genomu (obr. 2c). Geny s hodnotou q (FDR) < 0,05 byly považovány za diferenciálně exprimované.

Identifikovali jsme 102, 174 a 72 diferenciálně exprimovaných transkriptů ve slinných buňkách H. medicinalis, H. orientalis a H. verbana. Protože se jedná o tři blízce příbuzné druhy pijavic lékařských, byly proteinové sekvence diferenciálně exprimovaných transkriptů seskupeny do ortologických klastrů, aby se zjednodušila následná funkční analýza. Identifikovali jsme 25 diferenciálně exprimovaných, ortologických klastrů společných třem druhům pijavic a 44 ortologických klastrů společných alespoň dvěma druhům pijavic (obr. 3, doplňkové tabulky 10-11). Většina sekvencí v identifikovaných ortologických shlucích odpovídá hypotetickým proteinům anotovaným v genomu H. robusta. Analýza konzervovaných domén v identifikovaných ortologických shlucích umožnila určit sekvence patřící do známých proteinových rodin.

Rozdílně exprimované geny H. medicinalis jsme analyzovali také pomocí sestavy jeho genomu. Čtení cDNA pro slinné buňky, svaly a nervovou tkáň (čtení byla získána z Archivu čtení sekvencí (SRA)) byla mapována na sestavu genomu. Pro nervovou tkáň jsme použili datovou sadu čtení pro ganglion 2 kvůli jeho lokalizaci v preorálních segmentech. Analýza diferenciální exprese identifikovala 42 genů jedinečných pro slinné buňky H. medicinalis (doplňková tabulka 12).

Proteomika sekrece slinných buněk

Pro proteomickou analýzu jsme odebrali SCS ze tří druhů pijavic lékařských, H. medicinalis, H. orientalis a H. verbana, které byly udržovány bez krmení po dobu nejméně 2 měsíců. SCS byly odebrány podle dříve popsané metody s určitými modifikacemi (viz Metody).

Způsob přípravy vzorku je pro výsledný repertoár identifikovaných proteinů rozhodující, protože SCS se skládá z nízkomolekulárních i vysokomolekulárních složek a obsahuje inhibitory proteináz, glykoproteinové komplexy a lipidy. Ty mohou tvořit komplexy s proteiny. Proto jsme kombinovali několik metod přípravy vzorků a několik technik hmotnostní spektrometrie, abychom pokryli co nejširší repertoár proteinů SCS. Soubory proteomických dat získané různými metodami přípravy vzorků a technikami hmotnostní spektrometrie jsme zkombinovali a vytvořili konečný seznam identifikovaných proteinů pro jednotlivé druhy pijavic lékařských.

V SCS H. medicinalis, H. orientalis a H. verbana jsme identifikovali 189, 86 a 344 proteinů a seskupili je do ortologických klastrů, jak je popsáno výše. Bylo zjištěno, že všechny tři druhy pijavic lékařských sdílejí 39 ortologických klastrů a 50 ortologických klastrů bylo společných alespoň pro dva druhy (obr. 3, doplňková tabulka 13). Kombinace transkriptomických a proteomických dat odhalila 25 ortologických klastrů genů exprimovaných jedinečně ve slinných buňkách (doplňková tabulka 11). Seznam jednotlivých složek SCS pijavic je uveden na obr. 3. Překvapivě geny kódující známé antikoagulanty SCS a proteiny související s krevní moučkou nevykazovaly rozdílnou expresi mezi slinnými buňkami a svaly. Abychom toto zjištění potvrdili, zkoumali jsme expresi saratinu, eglinu C, bdellinu, hirustasinu, destabilizázy, inhibitoru metalokarboxypeptidázy, apirázy a angiotenzin konvertujícího enzymu (ACE) pomocí PCR v reálném čase dalších, nezávislých tkáňově specifických knihoven cDNA zkonstruovaných pro slinné buňky a svaly. Výsledky PCR v reálném čase pro hirudin a destabilázu (doplňkový obrázek 8) toto zjištění potvrdily. To naznačuje, že geny kódující antikoagulanty a proteiny související s krevní moučkou se podílejí nejen na krevní výživě, ale přispívají i k dalším, dosud neznámým fyziologickým funkcím.

Níže charakterizujeme složky SCS zařazené do funkčních skupin a popisujeme jejich možné role v hemostáze. Sekvence proteinů a jejich zarovnání jsou uvedeny na doplňkových obr. 9-24.

Enzymy

Proteázy

Výsledky této studie ukazují, že metaloproteázy rodin M12, M13 a M28 jsou hlavními enzymatickými složkami SCS. Peptidázy M12B (ADAM/reprolysin) jsou velkou rodinou metaloproteináz podobných dezintegrinům, které mají širokou škálu funkcí a podílejí se na mnoha fyziologických procesech . Tyto enzymy se často vyskytují v hadích jedech, zatímco transkripty jsou pozorovány v sialotranskriptech různých hematofágních druhů . V hemostáze se vylučované proteázy rodiny M12 mohou podílet na inhibici adheze trombocytů a na změkčování sraženin v důsledku degradace fibrinogenu. Tyto proteázy vykazují kovově závislou proteolytickou aktivitu vůči proteinům extracelulární matrix (želatina, fibrinogen, fibronektin), čímž ovlivňují regulaci zánětu a imunitních reakcí.

U savců se proteázy rodiny M13 podílejí na vzniku a vývoji kardiovaskulárního systému a na regulaci neuropeptidů v centrálním nervovém systému . Jednou z jejich nejdůležitějších funkcí je aktivace biologicky aktivních peptidů, zejména peptidů podílejících se na regulaci krevního tlaku (angiotenzin a bradykinin). U savců je ACE důležitou součástí renin angiotenzinového systému (RAS). ACE je exprimována v sialotranskriptomech pijavice (Theromyzon tessulatum), šištic (Conidae), upířího plže (Colubraria reticulata) a druhů dvoukřídlých (Diptera) .

Identifikované sekvence exopeptidáz rodiny M28 patří mezi karboxypeptidázy typu Q, známé také jako lysozomální dipeptidázy nebo plazmatická glutamátkarboxypeptidáza (PGCP). Bylo prokázáno, že tyto peptidázy se podílejí na regulaci metabolismu vylučovaných peptidů v krevní plazmě a centrálním nervovém systému u savců . Zdá se, že tyto enzymy slouží k deaktivaci některých signálních peptidů v krvi a jsou součástí hemoglobinolytických systémů u hematofágních parazitů a hrají roli trávicích exopeptidáz . Pozoruhodné je, že sekrety slinných žláz pijavic obsahují inhibitory karboxypeptidáz, které pravděpodobně zabraňují předčasnému trávení krevní moučky jinými typy peptidáz .

Superoxid dismutáza (EC 1.15.1.1)

Identifikovali jsme sekvence vylučovaných enzymů z rodiny superoxid dismutáz (SODC, typ Cu/Zn). Tato rodina metaloproteinů je typická především pro eukaryota a podílí se na inaktivaci volných radikálů, která zpomaluje oxidační procesy. Superoxiddismutáza v krvi katalyzuje přeměnu superoxidu na molekulární kyslík a peroxid vodíku a zabraňuje tvorbě peroxynitritu a hydroxylových radikálů . Je zajímavé, že peroxynitrit může potlačovat hemostatickou funkci nitrací klíčových prokoagulantů , zatímco peroxid vodíku je klíčovou signální molekulou, která se podílí na regulaci mnoha procesů (koagulace, trombóza, fibrinolýza, angiogeneze a proliferace). U klíšťat se předpokládá, že se SODC podílí na regulaci kolonizace střevního traktu bakteriemi, včetně původců onemocnění . Zdá se, že u SCS vykazuje SODC spolu s dalšími proteiny vrozeného imunitního systému antibakteriální účinek a zabraňuje nežádoucí oxidaci krve během krmení a trávení. Pozoruhodné je, že sloučeniny obsahující hem a volné železo se podílejí na tvorbě volných radikálů a provokaci oxidačního stresu .

Karbonanhydráza (EC 4.2.1.1)

Tento enzym je klíčovou součástí bikarbonátového pufračního systému a podílí se na regulaci hodnot pH v krvi, trávicím traktu a dalších tkáních . U hematofágních živočichů může tento enzym udržovat optimální podmínky pro trávení krevní potravy . Zdá se, že karbonická anhydráza způsobuje lokální zvýšení acidózy v místě kousnutí a snižuje aktivitu faktorů krevní srážlivosti.

Hyaluronidáza (EC 3.2.1.35)

Tyto enzymy jsou běžné v proteomických a transkriptomických datech hematofágních a jedovatých zvířat. Je známo, že slinné sekrety různých druhů pijavic obsahují hyaluronidázu (heparinázu, orgelázu) . V proteomu a transkriptomu jsme nalezli tři shluky obsahující doménu glykosylhydroláz rodiny 79 (O-glykosylhydrolázy). Tato rodina zahrnuje heparinázy, které hrají důležitou roli v pojivových tkáních. V jedech a sekretech slinných žláz tyto enzymy katalyzují hydrolýzu kyseliny hyaluronové, což vede ke ztrátě strukturální integrity extracelulární matrix, a tím usnadňují průnik antikoagulancií a dalších účinných molekul hlouběji do tkání . Kromě toho nízkomolekulární heparin produkovaný štěpením heparinázou potlačuje a inhibuje srážení krve .

Apyráza (EC 3.6.1.5)

Apyrázy jsou nukleotidázy podílející se na enzymatickém rozkladu ATP a ADP na AMP. Vylučované apyrasy a 5′-nukleasy jsou dobře známé a dobře charakterizované složky sekretů slinných žláz jedovatých a hematofágních živočichů, včetně pijavic . Apyrasy jsou antikoagulanty, protože odstraňují ADP, důležitý induktor agregace krevních destiček v místech poranění tkání .

Adenosin/AMP deaminasa (EC:3.5.4.4)

katalyzuje hydrolytickou deaminaci adenosinu za vzniku inosinu. Adenosin deaminázy jsou dobře prozkoumány a byly nalezeny ve slinách různého krev sajícího hmyzu . ADA se nachází také v sekretu slinných žláz upířího plže C. reticulata, který patří do rodu Spiralia, a také v pijavicích . Předpokládá se, že ADA hraje důležitou roli při odstraňování adenosinu, protože se podílí na procesech vnímání bolesti .

Inhibitory proteinas

Antistasiny

Identifikovali jsme sekvence odpovídající inhibitoru proteinas I15 (antistasin pijavice) Obr. 4. Inhibitor proteinas I15. Proteiny této rodiny se běžně vyskytují u pijavic sajících krev a hrají klíčovou roli v inhibici srážení krve. Jejich hlavním cílem jsou serinové proteázy účastnící se hemostázy, jako je faktor Xa, kallikrein, plazmin a trombin . Bylo prokázáno, že Ghilanten, antistasin z Haementeria ghilianii, inhibuje agregaci krevních destiček , a nedávno bylo zjištěno, že gigastasin z obří amazonské pijavice (Hementaria ghilianii) účinně inhibuje komplement C1 . Antistasin z Hementeria officinalis je nejbližším homologem sekvencí identifikovaných v naší studii.

CAP/CRISP

Superrodina proteinů CAP (cysteine-rich secretory protein/antigen 5/pathogenesis-related 1 proteins) zahrnuje řadu proteinových rodin, zejména CRISP (cysteine-rich secretory protein) Obr. 5a. Běžně se vyskytují v jedech hadů a dalších plazů a většina z nich jsou toxiny . V některých výzkumech se předpokládalo, že CRISP z hematofágních druhů se podílejí na hemostáze (HP1). Identifikované sekvence vykazují podobnost s proteinovými sekvencemi z hematofágních parazitických hlístic Ancylostoma caninum (měchovec), jako je blokátor draslíkových kanálů AcK1 a možný inhibitor agregace krevních destiček HPI , a také s hadími toxiny triflinem (Protobothrops flavoviridis) a natrinem-1 (Naja atra) . Mezi diferenciálně exprimovanými geny jsme identifikovali sekvence s novým motivem „bohatým na Cys“ Obr. 5b. Tato skupina proteinů se vyznačuje přítomností signálního peptidu a dvou cysteinových vzorů CX {5,14}. CX {7} CX {8} СС {2} С a CX {7,17} CX {9} CX {8} СС {2} С.

Eglin-like

Egliny jsou malé proteiny bez cysteinu, které patří do rodiny I13 inhibitorů serinových proteináz . Egliny z pijavic mají inhibiční aktivitu proti neutrofilním elastázám a katepsinům G a také se podílet na ochraně obsahu plodnic před předčasnou proteolýzou . Za zmínku stojí, že sekvence identifikované v této studii mají nízkou homologii s klasickým eglinem z pijavice Obr. 6a.

Cystatin

Sekvenci cystatinu jsme identifikovali pouze v proteomu H. verbana. Cystatiny jsou malé proteinové inhibitory cysteinových proteáz (katepsinů B, H, C, L, S) a často se vyskytují v sialotranskriptomech různých klíšťat . U klíšťat hrají cystatiny důležitou roli v procesech souvisejících s imunitní odpovědí, regulací endogenních cysteinových proteáz podílejících se na trávení krve a detoxikaci hemu . Hlístice Nippostrongylus brasiliensis využívá cystatiny k tomu, aby se vyhnula imunitnímu systému hostitele .

Doména PAN

Tato doména je přítomna v mnoha proteinech, včetně krevních proteinů plazminogenu a koagulačního faktoru XI . Je známo, že PAN/apple doména plazmatického prekallikreinu zprostředkovává jeho vazbu na vysokomolekulární kininogen a PAN/apple doména faktoru XI se váže na faktory XIIa a IX, krevní destičky, kininogen a heparin . Bylo zjištěno, že sekret slinných žláz pijavice H. officinalis obsahuje protidestičkový protein (LAPP), který má doménu PAN a podílí se na hemostáze. Tento protein vykazuje afinitu ke kolagenům I, III a IV, a tím inhibuje adhezi destiček zprostředkovanou kolagenem .

Alfa-2-makroglobulin (α2M)

Vysoce konzervovaný, multifunkční α2M se podílí na inhibici široké škály proteáz (serinové, cysteinové, asparaginové a metaloproteázy), interaguje s cytokiny a hormony a hraje roli v chelataci zinku a mědi . Může působit jako inhibitor plazminu, čímž inhibuje fibrinolýzu, ale v některých případech inhibuje koagulaci tím, že inaktivuje trombin a kallikrein . Předpokládá se, že tento protein se podílí nejen na imunitních procesech pijavic, ale je také důležitou součástí sekrece slinných žláz, která zvyšuje antikoagulační procesy.

Molekuly podílející se na adhezi

Fikolin

Fikoliny jsou součástí vrozeného imunitního systému a spouštějí lektinově závislou cestu aktivace komplementu . U bezobratlých se fikoliny podílejí na rozpoznávání složek buněčné stěny bakterií . Doména podobná fibrinogenu je přítomna v proteinech s afinitou k erytrocytům, např. v tachylektinu-5A (TL5A). TL5A vykazuje silnou hemaglutinační a antibakteriální aktivitu v přítomnosti iontů Ca2+ . U jedů plazů se předpokládá, že bílkoviny podobné fikolinu, ryncolin (z Cerberus rynchops) a veficolin-1 (UniProt: E2IYB3) (z Varanus komodoensis), spouštějí agregaci krevních destiček a srážení krve.

Doména F5/8 typu C

Řada identifikovaných sekvencí obsahuje jeden nebo několik diskoidinových motivů (DS), známých jako doména F5/8 typu C. V některých sekvencích se vyskytují i bílkoviny podobné fikolinu. Tato doména je přítomna v mnoha transmembránových a extracelulárních proteinech, např. v neuropilinech, neurexinu IV a receptorových proteinech s diskoidinovou doménou, a v proteinech zapojených do hemostázy, jako jsou koagulační faktory V a VIII . DS doména hraje důležitou roli při vazbě různých molekul ligandů, včetně fosfolipidů a sacharidů . Díky těmto vlastnostem se proteiny obsahující DS aktivně podílejí na buněčné adhezi, migraci a proliferaci a aktivaci signálních kaskád . Zdá se, že proteiny obsahující DS domény pijavic působí jako lektiny s vysokou afinitou ke galaktóze a mohou být součástí vrozeného imunitního systému pijavic. Kromě toho se mohou vázat na kolagen nebo fosfatidylserin na povrchu krevních destiček a endotelu, a tak kompetitivní inhibicí narušovat interakce mezi hemostatickými faktory.

Rodina receptorů pro lipoproteiny s nízkou hustotou a

Rodina receptorů pro lipoproteiny s nízkou hustotou (LDLR) je důležitou součástí krevní plazmy a podílí se na rozpoznávání a endocytóze lipoproteinů s nízkou hustotou v krvi savců . Na rozdíl od známých homologních proteinů jsou tyto receptory spíše sekrečními než membránovými proteiny a obsahují čtyři opakování LDLR třídy A (bohaté na cystein). Předpokládá se, že někteří bezobratlí, včetně segmentovaných červů, nejsou schopni syntézy cholesterolu a steroidních hormonů a během krmení získávají pijavice cholesterol především z krve hostitele jako exogenní zdroj . Předpokládáme, že tento protein může být pijavicemi využíván k vychytávání a transportu lipoproteinových komplexů bohatých na cholesterol.

Lektin typu R

Proteiny, které obsahují ricinovou doménu beta-střevního lektinu, byly nalezeny u prokaryot a eukaryot. U živočichů vykazují lektiny typu R různé aktivity . Jsou přítomny ve scavengerových receptorech (manóza, fukóza, kolagenové receptory), N-acetylgalaktosaminltransferázách, hemolytických toxinech (CEL-III z Cucumaria echinata) a cytotoxinech indukujících apoptózu . Již dříve byly podobné sekvence identifikovány v transkriptomech pijavic; autoři však předpokládali, že tato molekula má mitochondriální lokalizaci . Dalším pozoruhodným blízkým homologem je lektin EW29 vázající galaktózu z žížaly Lumbricus terrestris . EW29 se skládá ze dvou homologních domén a bylo experimentálně prokázáno, že vykazuje hemaglutinační aktivitu . Vzhledem k tomu, že mnoho známých lektinů typu R se podílí na adhezi a spouští hemolýzu , je tato molekula zajímavá pro další studium.

doména vWFA

Tato doména je přítomna v různých plazmatických proteinech: faktorech komplementu, integrinech a kolagenech VI, VII, XII a XIV . Jedním z proteinů identifikovaných v proteomu pijavice je vylučovaný protein, který se skládá ze čtyř kopií domény vWFA Obr. 7. Sekvence obsahuje několik předpokládaných rozpoznávacích míst: adhezní místo závislé na iontech kovů (MIDAS), vazebné místo pro integrin a kolagen a vazebné místo pro glykoprotein Ib (GpIb). Podle analýzy BlastX je tato doména homologní s kolagenem typu VI. Vzhledem k doménovému uspořádání proteinu a přítomnosti vazebných míst pro glykoprotein a kolagen zahrnuje jeden z předpokládaných mechanismů účinku vazbu na povrch endotelu nebo krevních destiček, čímž zabraňuje jejich interakci s kolagenem. Tato vazba je základem kompetitivní inhibice během hemostázy (odstraňování destiček) .

.