DDRGK1 je nutná pro homoeostázu ER
Pro pochopení buněčné funkce DDRGK1 jsme zkoumali účinky vyřazení DDRGK1 pomocí směsi dvou siRNA, jak bylo popsáno dříve21. Zjistili jsme, že knockdown DDRGK1 vyvolal apoptotickou buněčnou smrt u buněk MCF7 i HepG2, charakterizovanou barvením Annexin V/PI (obr. 1a), aktivací kaspázy-3 a štěpením PARP (obr. 1b). Je třeba poznamenat, že štěpení kappázy-3 můžeme detekovat u buněk HepG2 vyvolané knockdownem DDRGK1, ale ne u buněk MCF7, protože buňky MCF7 mají kaspázu-3 deficientní22. Kvantitativní analýza PCR v reálném čase (Q-PCR) ukázala, že knockdown DDRGK1 zvýšil expresi proapoptotických genů BAX, BAK, NOXA, DR5 a Bid, zatímco exprese anti-apoptotického genu Bcl-2 byla snížena (obr. 1c,d). Důležité je, že jsme zjistili, že vyřazení DDRGK1 v buňkách MCF7 a HepG2 vyvolalo reakci na stres ER se zvýšenou expresí genů specifických pro stres ER BiP, HSPA8 a CHOP (obr. 1e,f).
Pro další potvrzení, že se DDRGK1 podílí na reakci na stres ER, jsme stanovili vliv DDRGK1 na přežití buněk po ošetření induktory stresu ER thapsigarginem (Tg) a tunikamycinem (Tm). Knokautace DDRGK1 zvýšila apoptózu vyvolanou stresem ER při léčbě Tg u buněk HepG2 i MCF7, což bylo hodnoceno pomocí barvení Annexin V/PI a štěpení kaspázy-3 a PARP (obr. 2a-c a doplňkový obr. 1A-C). Naopak nadměrná exprese DDRGK1 snížila buněčnou smrt vyvolanou ER stresem u buněk HepG2 (obr. 2d-f). Kromě toho byla životaschopnost buněk MCF7 hodnocena pomocí MTT testu a výsledky ukázaly, že knockdown DDRGK1 učinil buňky citlivějšími na léčbu Tg nebo Tm, přičemž se snížila životaschopnost buněk (doplňkový obr. 1D), zatímco nadměrná exprese DDRGK1 podpořila přežití buněk po léčbě Tg nebo Tm (doplňkový obr. 1E). Celkově naše výsledky naznačují, že DDRGK1 hraje zásadní roli v regulaci homoeostázy ER.
DDRGK1 moduluje UPR
Pro pochopení toho, jak DDRGK1 reguluje homoeostázu ER, jsme nejprve analyzovali změny hladin proteinů tří senzorů UPR a jejich následných cílů v buňkách s deplecí DDRGK1. Výsledky ukázaly, že knockdown DDRGK1 v buňkách MCF7 a HepG2 významně snížil hladiny celkového IRE1α, ale slabě snížil fosforylovaný IRE1α (p-IRE1α), což může být způsobeno sníženou hladinou celkového IRE1α (obr. 3a). Hladiny ATF6 a štěpeného ATF6 nebyly ovlivněny (obr. 3a). Zajímavé je, že knockdown DDRGK1 neovlivnil hladiny celkového PERK, ale hladiny fosforylovaného PERK (p-PERK) a BiP byly významně zvýšeny (obr. 3a). Poté jsme zkoumali vliv deplece DDRGK1 na substrát IRE1α XBP1. Výsledky ukázaly, že XBP1s, sestřihová forma XBP1, se v buňkách MCF7 s knockdownem DDRGK1 významně snížila v závislosti na čase (obr. 3b), což korelovalo se změnami hladin proteinu IRE1α (doplňkový obr. 2A). Deplece DDRGK1 navíc zvýšila hladiny fosforylace eIF2α (p-eIF2α) a exprese CHOP v buňkách MCF7 i HepG2 (doplňkový obr. 2B). Tyto výsledky naznačují, že deplece DDRGK1 potlačuje signalizaci UPR-IRE1α a aktivuje apoptotickou dráhu UPR-PERK, která následně spouští apoptózu, jak bylo pozorováno na obr. 1 a 2. Hladina IRE1α se však u buněk s nadměrnou expresí DDRGK1 zvýšila v závislosti na dávce (obr. 3c), zatímco hladiny p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP a sestřihové formy XBP1 se významně nezměnily (obr. 3c; doplňkové obr. 2C a D). Abychom prozkoumali funkční vztah mezi DDRGK1 a UPR, hodnotili jsme dynamické změny IRE1α a PERK v buňkách MCF7 s vyřazeným DDRGK1 a v kontrolních buňkách po léčbě Tg v různých časových bodech. Léčba Tg podle očekávání zvýšila hladiny IRE1α a p-IRE1α, p-PERK a BiP v kontrolních buňkách. Celkové hladiny IRE1α však byly významně sníženy (0-24 h), zatímco hladiny p-IRE1α byly mírně sníženy (4-24 h) v buňkách ochuzených o DDRGK1 ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 3d). Současně byla snížena hladina XBP1s v buňkách ochuzených o DDRGK1 ve srovnání s kontrolními buňkami (4-12 h) (obr. 3e). Hladina celkového PERK se nezměnila, ale hladina p-PERK byla v buňkách ochuzených o DDRGK1 významně zvýšena (0-12 h) (obr. 3d). Podobné výsledky byly získány u buněk HepG2 (doplňkové obr. 2E a F). Celkově naše výsledky naznačují, že deplece DDRGK1 způsobuje degradaci IRE1α a aktivaci PERK.
DDRGK1 reguluje UPR zacílením na IRE1α
UPR je spouštěna senzory stresu ER při stresu ER za účelem regulace homoeostázy ER8. Bylo zjištěno, že hepatocytárně specifická delece IRE1α u myší vedla k aktivaci dráhy UPR-PERK23. Abychom zjistili, zda indukce p-PERK pozorovaná v buňkách s deplecí DDRGK1 byla zprostředkována sníženou hladinou IRE1α, zkoumali jsme hladiny p-PERK, PERK a jeho následných cílů v buňkách s deplecí IRE1α. Výsledky ukázaly, že knockdown IRE1α významně zvýšil hladiny proteinů p-PERK a p-eIF2α v buňkách MCF7 i HepG2 (obr. 4a), podobně jako u buněk s deplecí DDRGK1 (obr. 3a; doplňkový obr. 2B). Tyto výsledky naznačují, že DDRGK1 reguluje UPR prostřednictvím cílení na IRE1α. Poté jsme zkoumali, jak DDRGK1 reguluje IRE1α. Naše výsledky ukázaly, že hladiny proteinu IRE1α, ale nikoli mRNA (doplňkový obr. 3A), byly v buňkách s vyřazeným DDRGK1 dramaticky sníženy (obr. 3a). Léčba buněk inhibitorem proteazomu MG132 zablokovala snížení proteinu IRE1α zprostředkované DDRGK1 (obr. 4b; doplňkový obr. 3B). Dále jsme pozorovali, že deplece DDRGK1 dramaticky snížila poločas rozpadu IRE1α v testu s cykloheximidem (obr. 4c). V souladu s těmito pozorováními jsme zjistili, že ektopická exprese IRE1α zlepšila přežití buněk v buňkách MCF7 i HepG2 s deplecí DDRGK1 ve srovnání s kontrolními buňkami, charakterizované barvením Annexin V/PI a aktivací kaspázy-3 (obr. 4d,e; doplňkové obr. 3C a D). Celkově tyto výsledky naznačují, že DDRGK1 reguluje stabilitu IRE1α, a tím reguluje UPR.
DDRGK1 interaguje s IRE1α
Pro pochopení toho, jak DDRGK1 reguluje stabilitu IRE1α, jsme testovali, zda DDRGK1 interaguje s IRE1α pomocí testu reciproční imunoprecipitace (IP) v buňkách HEK293T. Výsledky ukázaly, že exogenně exprimovaný Flag-IRE1α specificky interagoval s endogenním DDRGK1 a BiP (obr. 5a). V souladu s tím exogenně exprimovaný Flag-DDRGK1 specificky interagoval s endogenním IRE1α a známým proteinem C53 asociovaným s DDRGK1 (ref. 14). V imunoprecipitátech Flag-DDRGK1 jsme však nedokázali detekovat BiP (obr. 5b), což naznačuje, že DDRGK1 nemusí přímo interagovat s BiP. IRE1α jako endogenní substrát degradace asociované s ER (ERAD) je degradován prostřednictvím asociace mezi IRE1α a komplexem Sel1L-Hrd1 ERAD způsobem závislým na BiP24. Proto jsme zkoumali, zda se BiP podílí na interakci mezi DDRGK1 a IRE1α. Výsledky ukázaly, že interakce mezi DDRGK1 a IRE1α nebyla knockdownem BiP ovlivněna (doplňkový obr. 4). Pro další potvrzení interakce DDRGK1 s IRE1α jsme provedli imunofluorescenční barvení. Výsledky ukázaly, že tyto dva proteiny se společně lokalizovaly v ER (obr. 5c). Abychom zmapovali oblast, která se podílí na interakci IRE1α s DDRGK1, provedli jsme ko-transfekci mutantů Flag-IRE1α divokého typu a zkráceného typu spolu s DDRGK1 do buněk HEK293T a výsledky IP ukázaly, že cytoplazmatická kinázová doména IRE1α je nezbytná pro její interakci s DDRGK1 (obr. 5d). Pro pochopení dynamických změn v interakci mezi DDRGK1 a IRE1α za podmínek ER stresu byly buňky HEK293T transfekovány Flag-DDRGK1 a ošetřeny Tg po různou dobu. Podle očekávání jsme pozorovali, že celkový počet IRE1α, p-IRE1α a BiP se při stresu ER významně zvýšil. Zajímavé je, že jsme zjistili, že DDRGK1 v imunoprecipitátech specificky interagoval s nefosforylovaným IRE1α, ale ne s p-IRE1α (obr. 5e). Tyto výsledky naznačují, že DDRGK1 interaguje s nefosforylovaným IRE1α a udržuje jeho stabilitu.
Ufm1 je nutný pro interakci DDRGK1 a IRE1α
Nedávná studie prokázala, že DDRGK1 je substrátem pro ufmylaci a je nutný pro ufmylaci ASC115,20 . Abychom zjistili, zda se ufmylace podílí na regulaci stability IRE1α pomocí DDRGK1, zkoumali jsme, zda deplece Ufm1 ovlivňuje expresi proteinu IRE1α. Podobně jako u deplece DDRGK1 jsme pozorovali, že knockdown exprese Ufm1 dramaticky snížil hladiny proteinu IRE1α (obr. 6a), což naznačuje, že DDRGK1 reguluje IRE1α prostřednictvím ufmylace. V souladu s tím jsme zjistili, že nadměrná exprese DDRGK1 nedokázala stabilizovat protein IRE1α v buňkách MCF7 s vyřazeným Ufm1 ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 6b). Kromě toho byly hladiny proteinu IRE1α dramaticky sníženy v buňkách MCF7 s vyřazeným Ufm1 jak v nepřítomnosti, tak v přítomnosti Tg (obr. 6c), což naznačuje, že pro regulaci stability proteinu IRE1α pomocí DDRGK1 je nutná ufmylace. Poté nás zajímalo, zda IRE1α podléhá modifikaci ufmylací. Abychom se touto otázkou zabývali, zjišťovali jsme ufmylaci IRE1α v buňkách exprimujících DDRGK1 a Ufm1 a také UBA5 (E1), UFC1 (E2) a UFL1 (E3), jak bylo popsáno dříve20. Nebyli jsme však schopni detekovat žádnou ufmylaci proteinu IRE1α, ačkoli ufmylace proteinu DDRGK1 byla snadno detekovatelná, jak bylo popsáno dříve (údaje nejsou uvedeny)15,20,25 , což naznačuje, že IRE1α nemusí být cílem ufmylace. Zajímavé je, že jsme zjistili, že asociace mezi DDRGK1 a IRE1α byla významně snížena v buňkách HEK293T s vyřazeným Ufm1 ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 6d). V souladu s tímto pozorováním jsme zjistili, že interakce DDRGK1 K267R (mutant DDRGK1 s nedostatkem ufmylace, u kterého byl lysinový zbytek 267 nahrazen argininovým zbytkem)15 s IRE1α byla dramaticky snížena ve srovnání s divokým typem DDRGK1 (obr. 6e), což naznačuje, že ufmylace DDRGK1 je nutná pro asociaci mezi DDRGK1 a IRE1α. Kromě toho DDRGK1 K267R nedokázal stabilizovat protein IRE1α ve srovnání s divokým typem DDRGK1 (obr. 6f). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že ufmylace DDRGK1 na K267 je nutná pro jeho interakci s IRE1α a regulaci stability proteinu IRE1α.
DDRGK1 je nutná pro schopnost rekonstituce HSC u myší
Nedávná studie naznačila, že hematopoetické kmenové buňky (HSC) jsou extrémně citlivé na stres ER26. To nás vedlo k domněnce, že DDRGK1 by mohla mít zásadní význam pro funkci HSC. Nejprve jsme stanovili úroveň exprese DDRGK1 ve více hematopoetických liniích dvouměsíčních myší divokého typu. Q-PCR odhalila výrazně vyšší úroveň exprese DDRGK1 v HSC, včetně dlouhodobých HSC (LT-HSC), krátkodobých HSC (ST-HSC) a multipotentních progenitorů (MPP) (obr. 7a). Kromě toho byla hladina proteinu DDRGK1 vysoce exprimována v buňkách kostní dřeně (BM) obohacených o HSC Lineage-c-Kit+ ve srovnání s buňkami BM Lineage+c-Kit- (obr. 7b). Tato pozorování naznačují důležitou roli DDRGK1 v kmenových buňkách. Ke zkoumání úlohy DDRGK1 ve funkci HSC byly provedeny kompetitivní transplantační experimenty s HSC po lentivirálním vyřazení DDRGK1 (obr. 7c). Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) buňky z CD45.1 dárcovských myší byly transdukovány kontrolním nebo DDRGK1-knockdown lenvirem a transplantovány do letálně ozářených CD45.2 recipientních myší. Průtoková cytometrická analýza ukázala, že procento dárcovských buněk periferní krve (PB) bylo významně sníženo ve skupině s knockdownem DDRGK1 ve srovnání s kontrolní skupinou, což naznačuje, že knockdown DDRGK1 významně zhoršil kompetitivní rekonstituční schopnost HSC (obr. 7d). Zatímco v nekompetitivním transplantačním experimentu příjemci myši transplantovaní s HSCs s knockdownem DDRGK1 ještě žili 3 měsíce po transplantaci, naznačuje to, že knockdown DDRGK1 pouze narušoval kompetitivní rekonstituční schopnost HSCs. Abychom vyloučili účinky mimo cíl, navrhli jsme další shRNA zaměřenou na DDRGK1 a pozorovali jsme podobné výsledky (doplňkový obr. 5A). Tři měsíce po transplantaci byly myši-příjemkyně utraceny za účelem analýzy BM a testů tvorby kolonií in vitro. Průtoková cytometrická analýza ukázala, že knockdown DDRGK1 dramaticky zhoršil udržení transdukovaných HSC bez ovlivnění jejich lineárního potenciálu (tj. myeloidní, B buněčné a T buněčné linie), jak ukazuje snížená frekvence dárcovských hematopoetických kmenových a progenitorových buněk a také diferencovaných hematopoetických buněk v BM a PB (obr. 7e). Podobný výsledek byl pozorován v nezávislém experimentu s použitím jiné shRNA cílené na DDRGK1 (doplňkový obr. 5B). Dále jsme izolovali dárcovské CD34-Flt3-LSK buňky (LT-HSCs) od myší příjemců a provedli test tvorby kolonií z jedné buňky. Výsledky ukázaly, že knockdown DDRGK1 zhoršil schopnost HSCs tvořit střední a velké kolonie (obr. 7f). Celkově tato data naznačují, že DDRGK1 je nutná pro zachování funkce HSC.
Abychom zjistili, zda je zhoršená funkce HSC způsobena sníženou účinností navádění, označili jsme kontrolní nebo sh-DDRGK1 lentivirem transdukované LSK buňky purifikované z dvouměsíčních myší fluorescenčním barvivem (fialová) a vstříkli je letálně ozářeným příjemcům. Procento označených LSK buněk přítomných v BM příjemce 18 hodin po transplantaci bylo analyzováno průtokovou cytometrií. Výsledky ukázaly, že homingová schopnost buněk LSK s vyřazeným DDRGK byla srovnatelná se schopností kontrolních buněk (doplňkový obr. 6A a B). Abychom zjistili, zda má knockdown DDRGK1 vliv na stav buněčného cyklu LSK buněk, obarvili jsme kontrolní a DDRGK1-knockdown LSK buňky odvozené od dárce proliferačním markerem Ki67 a DAPI a nezjistili jsme žádný významný rozdíl v profilech buněčného cyklu mezi DDRGK1-knockdown HSCs a kontrolními HSCs (doplňkový obr. 7A). Poté jsme zkoumali vliv DDRGK1-knockdown na apoptózu HSCs pomocí barvení Annexinem V a zjistili jsme významně vyšší frekvenci apoptózy u LSK buněk odvozených od dárce DDRGK1-knockdown ve srovnání s kontrolními LSK buňkami; tento jev byl pozorován u obou shRNA cílených na DDRGK1 (obr. 8a; doplňkový obr. 7B). Dále jsme zkoumali hladiny reaktivních forem kyslíku (ROS) v transdukovaných HSC. Výsledky ukázaly, že hladina ROS byla srovnatelná mezi kontrolní a DDRGK1-knockdown skupinou (doplňkový obr. 7C). Na základě výše uvedených pozorování jsme dospěli k závěru, že knockdown DDRGK1 v HSCs indukuje apoptotickou buněčnou smrt, a tím zhoršuje funkci HSC.
Pro zjištění, zda byla zhoršená funkce HSC způsobena aktivací stresové reakce ER v DDRGK1-knockdown HSC, jsme analyzovali hladiny exprese BiP a CHOP pomocí Q-PCR v kontrolních a DDRGK-knockdown transplantovaných HSC, výsledky ukázaly, že hladiny mRNA BiP a CHOP byly významně zvýšeny v DDRGK1-knockdown HSC (obr. 8b). Dále jsme zkoumali hladiny proteinů senzorů stresu ER v kontrolních a DDRGK-knockdownovaných buňkách Lineage-c-Kit+ BM. V souladu s pozorováním u nádorových buněčných linií vykázalo knockdown DDRGK1 snížení hladin proteinů IRE1α a p-IRE1α a zvýšení hladiny p-PERK, zatímco hladiny ATF6 se u kontrolní skupiny a skupiny s knockdown DDRGK1 nelišily (obr. 8c). V souladu s tím byla hladina XBP1s snížena v buňkách LSK odvozených od dárce s knockdownem DDRGK1 (obr. 8d). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že knockdown DDRGK1 narušil signalizaci IRE1α, ale aktivoval dráhu PERK, a dále podporují, že DDRGK1 je kritický pro správné udržení homoeostázy ER, a tím nezbytný pro přežití a udržení HSCs.
.