3.4 Modifikace inosinu a obrat mRNA
Modifikace mRNA z adenosinu na inosin (A-I) je katalyzována adenosin deaminázami, které působí na enzymy RNA (ADAR). Tyto enzymy upřednostňují dvouřetězcové oblasti RNA a přeměna A-I (v tomto oddíle popsaná také jako editace) změní párovací vlastnosti modifikovaných bází, protože se nyní budou párovat podobně jako guanin. Stejně jako dříve budeme oddělovat přímé účinky inosinu na stabilitu mRNA od těch, které vyplývají z nepřímých účinků. Zavedení inosinu do dvouřetězcových oblastí RNA může vyvolat degradaci prostřednictvím náboru ribonukleáz specifických pro RNA obsahující inosin. Prvním enzymem navrženým jako zprostředkovatel tohoto účinku je Tudor-staphylococcal nuclease (SN), u níž bylo prokázáno, že podporuje štěpení hypereditovaných dvouřetězcových RNA v extraktech . Většina výsledků popsaných v této studii prokazuje biochemickou aktivitu Tudor-SN na hypereditovaných substrátech in vitro. Z těchto studií však není jasné, jaká část mRNA obsahující inosin podléhá štěpení Tudor-SN in vivo a zda Tudor-SN byla či nebyla přímou endonukleázou. Bylo zjištěno, že Tudor-SN je lokalizován v cytoplazmatických stresových granulích , takže je možné, že některé z jeho cílových transkriptů mohou být přednostně regulovány během stresových podmínek. Druhou nukleázou, o níž je známo, že je specifická pro RNA obsahující inosin, je lidská endonukleáza V (hEndoV), která může in vitro štěpit různé substráty RNA obsahující inosin . Jedna studie naznačila, že hEndoV je skutečnou inosinovou endonukleázou, přičemž Tudor-SN poskytuje hEndoV stimulační aktivitu . Je zajímavé, že hEndoV se také lokalizuje v cytoplazmatických stresových granulích , což naznačuje podobnou funkci jako Tudor-SN při potenciální regulaci hladin mRNA obsahujících inosin během stresu. Celkově je sice zřejmé, že v eukaryotických buňkách existují nukleázové aktivity specifické pro inosin (obr. 5), ale jejich podíl na štěpení a obratu mRNA zůstává málo známý. Proto je třeba důkladněji prozkoumat fyziologický dopad štěpení hypereditované dsRNA pomocí Tudor-SN a/nebo hEndoV.
ADAR enzymy mohou také hrát významnou roli ve stabilitě mRNA tím, že regulují vazbu proteinů vázajících RNA, které ovlivňují rozpad mRNA. Vliv ADAR na hladinu jejich cílových mRNA byl měřen globálně a obecně jejich vliv na hladinu mRNA dobře nekoreluje s jejich schopností podporovat tvorbu inosinu v těchto mRNA . Spíše se zdá, že hlavní vliv ADARs na stabilitu mRNA je prostřednictvím náboru proteinu vázajícího RNA HuR (ELAVL1), který je hlavním regulátorem rozpadu mRNA. ADAR1 interaguje s HuR způsobem závislým na RNA a většina mRNA redukovaných v nepřítomnosti ADAR1 obsahuje vazebná místa HuR . Zdá se tedy, že ADAR1 ovlivňuje stabilitu svých cílových mRNA prostřednictvím náboru HuR do cílových míst nacházejících se v blízkosti. ADAR může také regulovat hladiny několika mRNA a ncRNA tím, že zabraňuje vazbě rozpadového faktoru PARN, což je poly(A)-specifická nukleáza . Tato funkce se také zdá být nezávislá na editaci, protože katalyticky neaktivní mutant ADAR je schopen plnit funkce enzymu při kontrole rozpadu. Zdá se tedy, že vliv ADAR na stabilitu jejich cílů mRNA je většinou nezávislý na jejich schopnosti podporovat tvorbu inosinu.
Významný důsledek modifikace inosinu na obrat mRNA je způsoben vlivem inosinu na regulaci genů zprostředkovanou mikroRNA. Přítomnost inosinu může ovlivnit dva hlavní kroky této dráhy: (i) biogenezi mikroRNA a (ii) specifičnost cílení mRNA mikroRNA. Pokud jde o vliv inosinu na biogenezi mikroRNA, bylo prokázáno, že primární prekurzory mikroRNA mohou být editovány pomocí ADAR1 nebo ADAR2 . Přítomnost inosinu v těchto prekurzorech má dva škodlivé účinky na produkci zralých mikroRNA . Za prvé, inosin snižuje účinnost zpracování primárních prekurzorů pomocí Drosha; za druhé, prekurzory obsahující inosin se nyní stávají cílem pro ribonukleázy specifické pro inosin, jako je Tudor-SN a/nebo hEndoV. Tyto kombinované účinky modifikace inosinu na primární prekurzory mikroRNA vedou ke snížení hladin mikroRNA produkovaných z těchto prekurzorů při současném zvýšení cílových mRNA. Tento proces může být regulován, neboť bylo prokázáno, že prekurzory mikroRNA miR-151 jsou během raného vývoje upravovány, což vede k degradaci prekurzorů pomocí Tudor-SN . Obecněji jsou prekurzory mikroRNA obsahující inosin degradovány během postzygotických stadií u myší . Tyto výsledky ukazují, že editace A-I prekurzorů mikroRNA může regulovat jejich biogenezi během vývoje, což následně přímo ovlivňuje expresi jejich cílových mRNA. Přesto je vliv ADAR na biogenezi mikroRNA komplexní, protože bylo také prokázáno, že ADAR1 heterodimerizuje s enzymem RNase III Dicer a zvyšuje tak účinnost zpracování mikroRNA , čímž hraje pozitivní roli v biogenezi mikroRNA. Komplexnost přímých a nepřímých účinků ADAR na biogenezi malých RNA byla rovněž prokázána v celém genomu Caenorhabditis elegans. A konečně, ADAR1 může také vázat siRNA nezávisle na úpravě RNA v savčích buňkách, což omezuje účinnost léčby siRNA . Zdá se tedy, že ADAR představují dvojsečnou zbraň pro umlčování genů zprostředkované mikroRNA a malými RNA, protože potlačující účinek modifikace inosinu na zpracování a stabilitu prekurzorů mikroRNA může být vyvážen schopností ADAR podporovat zpracování mikroRNA prostřednictvím jejich spojení s Dicerem a jejich vlivem na dostupnost siRNA. Nicméně tyto enzymy hrají klíčovou funkci při řízení buněčné diferenciace prostřednictvím úpravy prekurzorů mikroRNA. Například bylo prokázáno, že hypereditace prekurzoru mikroRNA Let-7 pomocí ADAR1 u leukémie podporuje obnovu leukemických kmenových buněk , což zdůrazňuje význam jemného vyladění editace prekurzorů mikroRNA během buněčné diferenciace.
Inosin také ovlivňuje regulaci mRNA zprostředkovanou mikroRNA tím, že ovlivňuje tvorbu duplexů RNA, což je rozhodující pro určení specifičnosti interakcí mikroRNA s mRNA (obr. 5). To bylo poprvé prokázáno tím, že zavedení inosinu do mikroRNA miR-376 vedlo k represi jiné skupiny mRNA oproti těm, které byly potlačeny nemodifikovanou miR-376 . Pokud se editované místo nachází v zárodečné sekvenci mikroRNA, vede modifikace ke změně specifity pro mikroRNA, protože inosin se přednostně páruje s bází C. Recipročně editace A-I v sekvencích 3′-UTR mRNA změní potenciální cílení těchto UTR mikroRNA a může vytvořit nová vazebná místa pro mikroRNA . Bylo prokázáno, že regulovaná editace je potenciálně důležitá při regulaci onkogenů a nádorových supresorových genů prostřednictvím mikroRNA během buněčné transformace .
Nakonec může inosin ovlivňovat stabilitu mRNA prostřednictvím nepřímých účinků. Bylo zjištěno, že mRNA obsahující inosin jsou v imunitních buňkách stimulovaných LPS omezeny na jádro , což brání jejich vystavení cytoplazmatickému mechanismu rozpadu mRNA. Zadržení těchto mRNA v jádře by je však vystavilo přednostní degradaci jadernými degradačními cestami, jako je jaderný exosom. To může vést ke zvýšení nebo snížení stability v závislosti na relativní účinnosti každé z těchto degradačních cest na konkrétní mRNA. Inosin také ovlivňuje alternativní sestřih, což by mohlo vést ke vzniku izoforem mRNA s různou stabilitou. To platí zejména v případě, že alternativně sestřihané druhy obsahují vazebná místa pro odlišné proteiny vázající RNA, které modulují jejich stabilitu. Proto mohou inosin a ADAR ovlivňovat stabilitu a expresi mRNA mnoha způsoby prostřednictvím kombinace přímých i nepřímých účinků.
.