Výsledky

Analýza klinických vzorků.

V září 2006 byl virus chřipky A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) izolován z několika 5 až 6 týdnů starých prasat s multifokální bronchopneumonií v komerční školce pro prasata z více zdrojů. Plicní léze zahrnovaly středně těžkou, subakutní až chronickou, hnisavou bronchopneumonii a intersticiální pneumonii s bronchiolitidou a peribronchitidou. Plicní tkáň byla negativní na virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV), prasečí cirkovirus typu 2 (PCV2) a Mycoplasma hyopneumoniae, ale byla pozitivní na Streptococcus suis. Vzhledem k charakteristickým změnám podobným chřipce a klinickým příznakům pneumonie byl homogenát plicní tkáně naočkován na buňky Madin-Darbyho psí ledviny (MDCK). Cytopatické účinky byly zjištěny 3. den po inokulaci (p.i.). Gen pro nukleoprotein (NP) viru chřipky byl detekován v infikovaných buňkách pomocí RT-PCR. Virus nereagoval s referenčními prasečími antiséry (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) v testech inhibice hemaglutinace (HI) a multiplexní RT-PCR nezjistila žádné geny H1N1 nebo H3N2 (14). Virus byl v únoru 2007 předán Národnímu centru pro nákazy zvířat (NADC) k určení podtypu a sekvenování.

Po určení podtypu a sekvenování zářijového izolátu (popsáno níže) bylo při vyhledávání v záznamech o případech zjištěno, že v dubnu 2006 byl předán další „netypizovatelný“ izolát chřipky. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) byl izolován z 12týdenního prasete s respiračním onemocněním na jiné komerční farmě chovatelů-finišerů prasat. Plicní léze byly histopatologicky charakteristické pro chřipku prasat (těžký subakutní zánět alveolů a bronchů s nekrózou a metaplazií bronchiálních epiteliálních buněk). Plíce byly negativní na PRRSV, PCV2 a M. hyopneumonia, ale byly pozitivní na virus chřipky A pomocí RT-PCR (specifický pro gen NP) a S. suis. Virus byl v březnu 2007 předán do NADC k subtypizaci a sekvenování.

Subtypizace a fylogenetická analýza.

Pro identifikaci a charakterizaci obou chřipkových virů bylo provedeno sekvenování nukleových kyselin a molekulární a fylogenetická analýza. Oba viry byly sekvenovány přímo z nízkopasivních izolátů pomocí buněk MDCK a sekvence byly potvrzeny po přečištění plaku a resekvenaci. Na základě nukleotidové sekvence a vyhledávání BLAST v databázi sekvencí chřipky (www.flu.lanl.gov) byly identifikovány jako viry H2N3. Úsek genu HA viru Sw/4296424 se nejvíce shodoval s viry H2 izolovanými z kachen divokých v Severní Americe . Jeho segment NA byl blízce příbuzný segmentu viru ptačí chřipky H4N3 (AIV) izolovaného z čírky modrokřídlé (98,3% identita). S výjimkou kyselého polymerázového genu (PA) byly jeho vnitřní geny odvozeny od současných trojnásobně asortantních virů prasečí chřipky, které se v současnosti vyskytují ve Spojených státech. Tyto viry nesou vnitřní geny pocházející z lidského (PB1), ptačího (PB2, PA) a prasečího chřipkového viru (tabulka SI 4). Jeho PA segment byl z 99,2 % identický s H6N5 AIV izolovaným z kachen divokých (SI tabulka 4). Viry Sw/2124514 a Sw/4296424 vykazovaly 99,3-99,9% celkovou identitu nukleotidových sekvencí (tabulka SI 5). Oba izoláty byly opakovaně klonovány, znovu testovány a sekvenováním potvrzena jejich příslušnost k podtypu H2N3. Podtyp H2N3 byl sérologicky potvrzen pomocí testů inhibice hemaglutinace a inhibice neuraminidázy. Fylogenetická analýza na základě genů HA a NA ukázala, že tyto dva viry patří do americké ptačí linie, která je odlišná od euroasijských ptačích kmenů a virů H2N2 izolovaných od lidí po pandemii chřipky v roce 1957 (obr. 1).

Molekulární analýza povrchových proteinů HA a NA.

Viry chřipky A obsahují dva povrchové proteiny: HA je glykoprotein vážící receptory a spojující membrány a NA je enzym ničící receptory. Virový HA je rozhodujícím faktorem druhové specifity chřipkových virů pro hostitele (15). Abychom charakterizovali zbytky v HA, které mohou souviset s adaptací ptačího viru na savčího hostitele, porovnali jsme aminokyselinové sekvence prasečích HA se sekvencemi předpokládaných referenčních ptačích virů. Molekulární srovnání molekul HA dvou prasečích izolátů H2N3 odhalilo, že se od domnělého referenčního viru H2N3 izolovaného z kachen divokých liší šesti společnými aminokyselinovými substitucemi (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I a L506V) (tabulka SI 6). V obou prasečích izolátech H2N3 byla nalezena záměna Q226L, zatímco pozice 228 obsahovala G, což je shodné s ptačí konsenzuální sekvencí (tabulka 1) (16). Naproti tomu lidské molekuly HA subtypu H2 obsahují 226L a 228S, zatímco časné lidské izoláty H2 obsahují 226L a 228G (tabulka 1), podobně jako prasečí izoláty. Pozice 36N, 274I, 316I a 419I jsou jedinečné pro dva prasečí izoláty H2N3 (tabulka SI 6), zatímco příslušné pozice v lidských a ptačích izolátech zobrazených na obr. 1 a jsou 36D, 274T, 316V a 419L. U chřipkových izolátů znázorněných na obr. 1 a je pozice 506V zachována u člověka, dvou prasečích izolátů H2N3 a ptačích izolátů, s výjimkou izolátu A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), jak je uvedeno v tabulce 6 SI. Při porovnání s referenčním virem H4N3 izolovaným z čírky modrokřídlé byly zjištěny dvě společné změny aminokyselin v aminokyselinové sekvenci NA obou prasečích izolátů: H47Y a H253Y (tabulka SI 7). Pozice 47Y u obou prasečích izolátů H2N3 je stejná jako příslušná aminokyselina u euroasijských ptačích izolátů zobrazených na obr. 1 b; naopak pozice u severoamerických ptačích izolátů je 47H. Pozice 253Y je jedinečná pro prasečí izoláty H2N3 a pozice 253H je konzervovaná v euroasijských a severoamerických ptačích izolátech zobrazených na obr. 1 b. Zajímavé je, že Sw/4296424 (H2N3), izolovaný o 5 měsíců později než Sw/2124514 (H2N3), měl dvě další substituce (P162S a L321V) v molekule HA a tři další substituce (V30I, I49T a A135T) v molekule NA ve srovnání s HA a NA Sw/2124514 (tabulky SI 6 a 7). Pozice 30I (Sw/4296424) v molekule NA je podobná euroasijským izolátům, zatímco pozice 30V (Sw/2124514) je zachována u severoamerických ptačích izolátů.

Patogenita a přenosnost virů chřipky prasat H2N3 u prasat.

Pro zjištění míry adaptace viru H2N3 na prasata jsme zkoumali jeho patogenitu u tohoto hostitele inokulací 20 čtyřtýdenních prasat 2 × 106 50% infekční dávkou tkáňové kultury (TCID50) viru Sw/4296424. Vzhledem k vysoké identitě obou izolátů byl vybrán pouze jeden virus H2N3. Dvanáct kontrolních prasat bylo pokusně naočkováno neinfekčním supernatantem buněčné kultury. Přenosnost jsme hodnotili společným chovem 10 věkově odpovídajících kontaktních prasat s inokulovanými prasaty, počínaje dnem 3 p.i. Všechna prasata použitá pro studii byla v den 0 séronegativní na protilátky proti virům prasečí chřipky H1N1, H1N2, H2N3 a H3N2 pomocí HI testu. Pět inokulovaných prasat a tři kontrolní prasata byla utracena za účelem nekropsie ve dnech 3, 5 a 7 p.i. Deset kontaktních prasat a pět prasat inokulovaných virem bylo sérologicky testováno pomocí HI testu s H2N3 ve 24. dni po kontaktu, resp. 27. den p.i. Nebyly pozorovány žádné akutní respirační příznaky. Nekropsie odhalila závažné makroskopické plicní léze (švestkově zbarvené, konsolidované oblasti) u inokulovaných prasat, ale u kontrolních prasat nebyly zjištěny žádné (tabulka 2). Histopatologické skóre (0-3) vyjadřující rozsah poškození plicní architektury bylo u inokulovaných prasat >2 (tabulka 2). Plíce inokulovaných prasat eutanazovaných 3., 5. nebo 7. den p.i. vykazovaly mírnou až středně těžkou intersticiální pneumonii a akutní až subakutní nekrotizující bronchiolitidu s mírnými lymfocytárními manžetami bronchiolů a cév (obr. 2). Virus byl titrován v tekutině z bronchoalveolární laváže (BALF) a izolován ze vzorků nosních stěrů. Titry viru v plicích se pohybovaly od 104,3 do 106,5 TCID50/ml ve dnech 3. a 5. p.i. (SI tabulka 8) a byly negativní v den 7. p.i. Ve skupině inokulované H2N3 byl virus izolován ze vzorků nosních výtěrů u 25 % (5 z 20) prasat v den 3, 67 % (10 z 15) v den 5 a 20 % (2 z 10) v den 7 p.i.; v kontaktní skupině bylo 10 % (1 z 10) vzorků pozitivních v den 5 a 7 po kontaktu. Naproti tomu 100 % (10 z 10) kontaktních prasat bylo séropozitivních po 24 dnech kontaktu s inokulovanými prasaty (tabulka 9 SI). U některých kontrolních prasat se příležitostně vyskytla malá ložiska mírné intersticiální pneumonie (tabulka 2), která však byla negativní na infekci virem chřipky prasat. Všechna prasata byla negativní na PRRSV a M. hyopneumoniae pomocí PCR. Naše výsledky naznačují, že virus H2N3 je u prasat patogenní a je přenosný mezi prasaty.

Patogenita virů prasečí chřipky H2N3 u myší.

Pro testování schopnosti viru H2N3 Sw/4296424 replikovat se u myší jsme 6 až 7 týdnů starým myším BALB/c intranazálně naočkovali 102-106 TCID50. Myši inokulované 104 TCID50 nebo více vykazovaly příznaky onemocnění (např. ztížené dýchání, drsná srst, úbytek hmotnosti a letargie) (tabulka 10 SI). Sedmdesát pět procent myší, které dostaly 106 TCID50, uhynulo, ale při nižších dávkách k žádnému úhynu nedošlo. Virová RNA byla zjištěna pomocí RT-PCR v reálném čase (17) v plicích myší po inokulaci 106 nebo 105 TCID50 (tabulka SI 10). Histopatologicky virus H2N3 vyvolal mnohočetná nebo koalescentní ložiska intersticiální pneumonie a proliferativní alveolitidy charakterizované výraznou hypertrofií pneumocytů a infiltrací alveolárních stěn smíšenou populací makrofágů, lymfocytů a neutrofilů (SI obr. 3). Některé alveolární lumeny obsahovaly fibrinové sraženiny a lehké smíšené leukocytární exsudáty. Celkově tato zjištění naznačují, že virus H2N3 je u myší patogenní bez předchozí adaptace.

Přenosnost viru prasečí chřipky H2N3 u fretek.

Aby virus chřipky A způsobil pandemii, musí infikovat člověka a účinně se přenášet mezi lidmi. Ke zkoumání potenciálu reassortantního viru H2N3 přenášet se v systémech savců jsme použili kontaktní model fretek (18). Tři 18týdenní fretky, umístěné v oddělených klecích, byly inokulovány 102,5 TCID50 viru H2N3 Sw/2124514. Po 24 hodinách bylo do každé klece umístěno jedno kontaktní zvíře. Ve dnech 1, 4 a 7 p.i. byly provedeny výplachy nosu a virus byl titrován v embryonálních vejcích. Virus byl zjištěn u všech očkovaných a kontaktních fretek, ale žádná z nich nevykazovala zjevné klinické příznaky (tabulka 3). Tyto výsledky naznačují, že virus chřipky H2N3 infikoval fretky a byl účinně přenášen kontaktem.

Serologické zkoumání virů chřipky prasat H2N3 v chovech, kde došlo k ohnisku nákazy.

Pro další zkoumání šíření virů H2N3 jsme provedli omezený sérologický průzkum zvířat spojených se dvěma postiženými produkčními systémy. V první studii byly na jaře 2007 odebrány vzorky séra prasnicím ze čtyř farem, které poskytly selata do školkařských farem během epidemie v září 2006. Devadesát procent z nich (54 z 60) bylo séropozitivních na přítomnost protilátek proti Sw/4296424 (tabulka SI 11). Řada testovaných zvířat byla přítomna v době výskytu indexového případu a není jasné, zda byla infikována v té době, nebo zda se nakazila následně. Údaje však ukazují, že virus byl přítomen v chovech prasnic i ve školkách a že se virus účinně přenášel mezi zvířaty. Všechny prasnice v této operaci měly titry protilátek >1:40 proti virům prasečí chřipky H1N1 a H3N2, protože byly předtím očkovány bivalentní vakcínou proti usmrcené chřipce H1N1 a H3N2.

Na jaře 2007 byly také odebrány vzorky séra od 30 prasnic a 90 odstavených prasat spojených s ohniskem v dubnu 2006 a byly testovány na přítomnost protilátek proti Sw/2124514 pomocí testu HI. Z 30 prasnic a 90 odstavených prasat, kterým byly odebrány vzorky, bylo 1 z 30 a 26 z 90 séropozitivních (tabulka 11 SI).

.