Růst a produkce etanolu S. cerevisiae NCYC 2826 na hydrolyzátu pšeničné slámy

Obrázek 1A ukazuje růst S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 pěstované při 30 °C po dobu 36 h v kultuře obsahující hydrolyzát s koncentrací glukózy 123 mM připravený podle popisu v části „Metody“. Kmen S. cerevisiae byl vybrán vzhledem k jeho uváděné vysoké toleranci k ethanolu a robustnosti při průmyslové fermentaci. Obrázek 1A ukazuje, že při kultivaci S. cerevisiae NCYC 2826 pouze na hydrolyzátu pšeničné slámy byla zaznamenána pomalá rychlost růstu μ 0,036 h-1 a konečná optická hustota (OD) 0,8. Přídavek Yeast nutrient base (YNB) do média způsobil zvýšení μ na 0,135 h-1 a konečnou OD 1,5, zatímco přídavek 2,3 mg ml-1 močoviny k hydrolyzátu pšeničné slámy vedl ke zvýšení μ na 0,99 h-1 a konečné OD 1,3. Předchozí studie ukázaly, že přídavky močoviny mohou zvýšit produkci ethanolu při kvasinkové fermentaci a že samotná močovina je nezbytnou součástí nejminimálnějších kvasinkových růstových médií . Naše výsledky podporují tato dřívější zjištění a potvrzují požadavek močoviny pro téměř optimální růst kvasinek. Po 36 hodinách byla změřena koncentrace ethanolu v kulturách a výtěžek ethanolu získaného ze 123 mM glukosy činil u všech kultur přibližně 90 % celkového teoretického výtěžku. Zatímco při těchto třech kultivačních podmínkách byl ethanol produkován se srovnatelným výtěžkem, u hydrolyzátu pšeničné slámy byl růst pomalejší a konečná optická hustota nižší, než když byla do kultury přidána močovina nebo YNB. To naznačuje, že ačkoli byla pro fermentaci k dispozici glukosa, hydrolyzát neobsahoval dostatečné množství nutričních prvků, které by kultuře umožnily dělit se maximální rychlostí a dosáhnout optimální hustoty.

Pro zkoumání příčiny sníženého růstu buněk na hydrolyzátu pšeničné slámy byla S. cerevisiae NCYC 2826 pěstována na hydrolyzátu vyrobeném s použitím 5%, 10%, 15% a 20% výchozí koncentrace slámy a doplněném o 2,3 mg ml-1 močoviny. Obrázek 1B ukazuje, že se zvyšující se počáteční koncentrací slámy se prodlužovala i lag fáze růstu až na 20 h při počáteční koncentraci slámy 20 %. S rostoucí koncentrací slámy se zvyšovala i konečná OD, a to v důsledku zvýšené koncentrace uvolněné glukózy. Zvýšená lag fáze je charakteristická pro inhibici růstu furanovými sloučeninami, které jsou často přítomny v hydrolyzátech slámy. Analýza obsahu furanů v hydrolyzátu ukázala, že obsah HMF byl zanedbatelný (údaje nejsou uvedeny), ale koncentrace přítomného furfuralu se zvyšovala s počáteční koncentrací slámy a dosáhla 0,5 mg ml-1 při 20% počátečním obsahu slámy (obr. 2). Tyto údaje naznačují, že růst S. cerevisiae NCYC 2826 na hydrolyzátu pšeničné slámy je omezen koncentrací furfuralu přítomného v hydrolyzátu.

Koncentrace glukózy (čtverce) a furfuralu (trojúhelníky) přítomného v hydrolyzátech pšeničné slámy vyrobených podle popisu v části “Metody“ s rostoucí koncentrací počáteční slámy.

Analýza růstu sady kmenů SGRP na furfuralu

Za účelem identifikace kmenů kvasinek, které mohou být odolné vůči kontaminujícímu furfuralu, byla sada kmenů SGRP popsaná v metodách pěstována v YNB, 100 mM glukóze a přítomnosti 1,5 mg ml-1 furfuralu. V tabulce 1 je uvedena analýza tolerance sady kmenů SGRP vůči 1,5 mg ml-1 furfuralu pomocí bodovacího systému popsaného v části „Metody“. Namísto průměrných dob zpoždění byl požadován bodovací systém, protože replikáty kmene, které nerostly, neměly měřitelnou fázi zpoždění, ale přesto musely být zahrnuty do souboru údajů.

Předtím jsme pozorovali, že zvýšení inokula do kultur obsahujících furfural vedlo ke snížení lag fáze, pravděpodobně maximalizací množství životaschopných kvasinkových buněk zavedených do média, což vedlo k rychlejšímu nastolení exponenciální fáze růstu (údaje nejsou uvedeny). Proto byl pro tyto experimenty použit 5% objem inokula noční kultury. Údaje v tabulce 1 ukazují, že růst na replikových destičkách byl velmi variabilní a také závislý na kmeni, což dokazuje, že koncentrace 1,5 mg ml-1 furfuralu je dostatečná k rozlišení tolerance vůči furfuralu u kmenů S. cerevisiae a S. paradoxus. Při testování růstu kmenů v YNB obsahujícím 100 mM glukosu a 2,0 nebo 3,0 mg ml-1 furfuralu byl pozorován velmi malý růst za obou těchto podmínek u všech analyzovaných kmenů. Proto bylo rozhodnuto vybrat kmeny na základě údajů o koncentraci 1,5 mg ml-1 a podrobit je podrobnějšímu screeningu na furfural. Analýza údajů uvedených v tabulce 1 ukazuje, že celkově kmeny S. cerevisiae rostly lépe než kmeny S. paradoxus na 1,5 mg ml-1 furfuralu. Téměř 20 % testovaných kmenů S. paradoxus nezískalo nejvyšší známku ve skórovacím systému, zatímco u S. cerevisiae to bylo méně než 10 %, což se také odrazilo ve vyšším průměrném celkovém skóre u S. cerevisiae 2,5 ± 1,4 oproti 2,1 ± 1,4 u S. paradoxus. V rámci každé skupiny kmenů však existovaly značné rozdíly, přičemž skóre se pohybovalo od 1,7 do 3,7 u S. cerevisiae a od 0,3 do 3,0 u S. paradoxus. Kmeny, které dosáhly skóre vyššího než 2,9 se směrodatnou odchylkou menší než 1,5, byly považovány za kmeny vykazující významnou toleranci vůči furfuralu. Proto byly kmeny S. cerevisiae NCYC 3284 (ex půda, USA), NCYC 3290 (ex biliové víno, západní Afrika), NCYC 3312 (ex půda, Nizozemsko) a NCYC 3451 (ex sladina, Irsko) spolu s kmenem S. paradoxus NCYC 3277 (ex dubová kůra, Spojené království) dále zkoumány v podrobnějším screeningu na furfural.

Vliv zvyšujících se koncentrací furfuralu na růst a produkci ethanolu

Obrázek 3 ukazuje růst v přítomnosti různých množství furfuralu (0,1 až 4,0 mg ml-1) pro kmeny S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 a NCYC 3451 a kmen S. paradoxus NCYC 3277, který byl v tabulce 1 ze souboru kmenů SGRP identifikován jako kmen se zvýšenou odolností vůči furfuralu. Doplňkový soubor 1: Obrázek S1 ukazuje odpovídající růstové údaje vynesené v logaritmickém měřítku. Pro srovnávací účely byl zahrnut také kontrolní kmen S. cerevisiae NCYC 2826. U všech šesti kmenů začaly růstové křivky se zvyšující se koncentrací furfuralu vykazovat nárůst lag fáze, jak bylo dříve pozorováno u růstů obsahujících furfural. Všechny testované kmeny byly schopny růst na YNB doplněném 100 mM glukózou a 0,1 až 1,5 mg ml-1 furfuralu. S. cerevisiae NCYC 2826, náš kontrolní kmen, byl schopen růst pouze na 1,5 mg ml-1 , což vedlo k 30% snížení konečné OD ve srovnání s růstem na 0,1 mg ml-1 furfuralu. Tabulka 2 ukazuje, že produkce ethanolu kmenem NCYC 2826 byla za těchto podmínek značně snížena ve srovnání s přibližně 90% výtěžkem pozorovaným při růstu na samotném YNB a glukóze nebo na hydrolyzátu pšeničné slámy. S. cerevisiae NCYC 2826 byla izolována z hroznového moštu, a proto je nepravděpodobné, že by se u ní vyvinula schopnost růstu a fermentace během expozice furfuralu.

Ve své populační genomické studii Liti et al. identifikovali pět dobře definovaných, geograficky izolovaných linií S. cerevisiae (malajská, severoamerická, saké, západoafrická a „vinná/evropská“) a také mnoho různých rekombinantních (mozaikových) kmenů těchto linií. Z výsledků této studie je zřejmé, že odolnost vůči furfuralu není fenotypovou vlastností specifickou pro jednu konkrétní linii S. cerevisiae. Ze čtyř identifikovaných SGRP kmenů S. cerevisiae odolných vůči furfuralu patří NCYC 3284 (YPS128) k severoamerické linii, NCYC 3290 (DBVPG 6044) k západoafrické linii, NCYC 3312 (DBVPG 1373) k „vinařské/evropské“ linii, zatímco NCYC 3451 (jednosporý derivát NCYC 361) je rekombinantní kmen.

S. cerevisiae NCYC 3451 vykazovala největší odolnost vůči furfuralu (Obrázek 3F, Doplňkový soubor 1: Obrázek S1F) a byla schopna růst v přítomnosti až 3,0 mg ml-1 furfuralu. Navíc se zdá, že produkce ethanolu u tohoto kmene nebyla furfuralem inhibována, přičemž nejvyššího výtěžku ethanolu (95 ± 15 %; tabulka 2) bylo dosaženo při koncentraci (furfuralu) 3,0 mg ml-1. Jak již bylo uvedeno, NCYC 3451 je rekombinantní kmen a bylo prokázáno, že má mozaikovitý genom odvozený nejméně ze tří různých linií, a to saké, západoafrické a „vinné/evropské“ (Liti et al. ). Ačkoli byl tento kmen izolován z mladiny jako kvasinka kazící pivo, vysoce komplexní struktura genomu tohoto kmene silně naznačuje, i když není prokázána, že je průmyslového původu (např. pekařský nebo pivovarský kmen). Ze zbývajících čtyř testovaných kmenů SGRP byly kmeny S. cerevisiae NCYC 3290 a NCYC 3312 schopny růst na 2,5 mg ml-1 furfuralu (obr. 3D,C, doplňkový soubor 1: obr. S1D, resp. S1C), zatímco kmeny S. cerevisiae NCYC 3284 (obr. 3E, doplňkový soubor 1: obr. S1E) a S. paradoxus NCYC 3277 (obr. 3B, doplňkový soubor 1: obr. S1B) mohly růst pouze na 2,0 mg ml-1 furfuralu. Celkově nebyla produkce ethanolu u pěti kmenů SGRP přítomností furfuralu významně ovlivněna. Ve skutečnosti u NCYC 3312 vedla přítomnost 0,5 mg ml-1 furfuralu ke znatelnému zvýšení výtěžku ethanolu, a to ze 41 ± 8 % očekávaného výtěžku na 75 ± 5 % (tabulka 2). To bylo pozorováno také u kmene NCYC 3451, který kazí pivo, ale v menší míře (pouze 14% zvýšení výtěžku; tabulka 2). Nedávno se totiž ukázalo, že malá množství furfurylalkoholu, produktu dehydratace furfuralu v kvasinkách, mohou skutečně vést ke zvýšení produkce ethanolu .

.