HYPERSEKRÉCE HLEJE A CHRONICKÁ RESPIRAČNÍ CHOROBA

Hypersekrece hlenu do dýchacích cest významně přispívá k morbiditě a mortalitě u mnoha pacientů se závažnými chronickými plicními chorobami, jako je chronická plicní obstrukční nemoc (CHOPN), astma a cystická fibróza.35 Nadměrné množství hlenu v dýchacích cestách může omezovat průtok vzduchu a jeho přítomnost je rizikovým faktorem zejména u pacientů s CHOPN, kteří jsou náchylní k hrudním infekcím. CHOPN je závažné chronické zánětlivé onemocnění dýchacích cest, které zahrnuje tři stavy, a to chronickou bronchitidu (dlouhodobou hypersekreci hlenu v dýchacích cestách), onemocnění malých dýchacích cest a emfyzém.36 Její prevalence a ekonomická zátěž celosvětově narůstá.37,38 U CHOPN mají pacienti s chronickou hypersekrecí hlenu významně zvýšené riziko hospitalizace a úmrtí ve srovnání s pacienty bez výrazné bronchitické komponenty.39,40 Současná léčba CHOPN je paliativní a nezastavuje progresi onemocnění41 a neexistuje žádná specifická léčba hypersekrece hlenu.42 Vzhledem k tomu, že neexistuje účinná léčba žádného aspektu patofyziologie CHOPN, je vývoj léčby hypersekrece hlenu opodstatněný. Schopnost odstraňovat hlen z plic prostřednictvím pohybu řasinek v dýchacích cestách závisí na jeho viskozitě a elasticitě. Tyto vlastnosti jsou určeny hmotnostním podílem mucinových glykoproteinů, které hlen obsahuje.43 MUC5AC a MUC5B jsou hlavními muciny v normálních i patologických lidských sekretech dýchacích cest.44 U pacientů s CHOPN jsou hladiny mucinů MUC5AC a MUC5B v respiračním hlenu zvýšené, i když se proporcionálně vylučuje více MUC5B.45 Muciny jsou do dýchacích cest vylučovány pohárkovými buňkami v epitelu a seromukózními žlázkami v submukóze.43 Jednou z možností inhibice sekrece hlenu je využití inhibiční aktivity klostridiových neurotoxinových endopeptidáz na fúzi vezikul, cílených na buňky dýchacích cest vylučující mucin pomocí vhodného cíleného ligandu.

Pro zjištění, zda by vhodně cílená klostridiová endopeptidáza štěpila proteiny SNARE v lidských epiteliálních buňkách dýchacích cest, a tím inhibovala sekreci hlenu, byl vytvořen fúzní protein z rekombinantního genu kódujícího doménu LHN BoNT/C a EGF, označený EGF-LHN/C, který cílí na receptory EGF na buňkách vylučujících mucin.34 EGF byl vybrán jako prototyp ligandu pro vytvoření takového fúzního proteinu, protože receptory EGF jsou přítomny na lidských epiteliálních buňkách dýchacích cest46,47 a jsou zvýšené v epitelu dýchacích cest u pacientů s astmatem a CHOPN48 a také u kuřáků49. Rekombinantní fúzní protein EGF-LHN/C štěpil příslušný SNARE protein syntaxin v lidské mukoepidermoidní metastatické buněčné linii H292 in vitro v závislosti na koncentraci.34 Předléčení buněk H292 EGF-LHN/C inhibuje stimulované uvolňování mucinu v reakci na kombinovaný podnět EGF a tumor nekrotizujícího faktoru-α (TNFα) v závislosti na koncentraci s IC50 přibližně 0,4 nM (obr. 28-1). To je velmi dobře srovnatelné s dříve popsaným inhibičním účinkem EGF-LHN/C na stimulované uvolňování mucinu z jiné linie respiračních epiteliálních buněk, lidské alveolární buněčné linie typu II A549, v reakci na stejný podnět.34 U obou typů buněk nebyl zjištěn žádný vliv EGF-LHN/C na bazální úroveň sekrece mucinu. Inhibice sekrece mucinu působením EGF-LHN/C je způsobena cíleným přenosem jeho endopeptidázové aktivity přes receptor EGF a není výsledkem buněčné cytotoxicity nebo antagonismu či downregulace receptoru.34 EGF-LHN/C je také schopen inhibovat stimulované uvolňování mucinu z buněk A549 v reakci na stimulační koktejl cytokinů, kombinaci 1 ng/ml interferonu (IFN)-γ, TNFα a interleukinu (IL)-1β, tzv. cytomix (obr. 28-2). Účinek EGF-LHN/C na stimulované uvolňování mucinu z buněk respiračního epitelu je tedy nezávislý na přesné povaze použitého stimulu. Histologické vyšetření ukazuje, že mucin zůstává uvnitř ošetřených buněk (obr. 28-3). Kontrolní buňky obsahují obarvený intracelulární mucin, zatímco stimulované buňky vykazují výrazně snížené obarvení, což svědčí o sekreci mucinu. Stimulované buňky předem ošetřené EGF-LHN/C vykazují zachované intracelulární barvení, což svědčí o inhibici sekrece EGF-LHN/C. Pro posouzení reakce buněk na toto zadržení intracelulárního mucinu byl měřen účinek předběžného ošetření EGF-LHN/C na hladiny mRNA MUC5AC jako ukazatele syntézy mucinu. Předběžná léčba EGF-LHN/C je spojena s inhibicí exprese mRNA MUC5AC vyvolané EGF-TNFα v závislosti na koncentraci s hodnotou IC50 ∼0,1 nM (obr. 28-4). Stejně jako v případě inhibice stimulovaného uvolňování mucinu z buněk je tento účinek EGF-LHN/C způsoben cíleným přenosem jeho endopeptidázové aktivity prostřednictvím receptoru EGF, protože ani LHN/C postrádající ligand EGF, který by jej na receptor EGF zacílil, ani mutovaná forma fúzního proteinu, v níž byla endopeptidázová doména inaktivována změnou tří zbytků v katalytické oblasti (EGF-TE-LHN/C), neinhibují expresi mRNA MUC5AC. Tento účinek EGF-LHN/C na expresi mRNA MUC5AC naznačuje existenci možného mechanismu negativní zpětné vazby mezi uvolňováním mucinu a syntézou mucinu v buňkách respiračního epitelu a také to, že exprese genu se snižuje v reakci na inhibici sekrece rekombinantní klostridiovou endopeptidázou.

Rekombinantní fúzní proteiny klostridiové endopeptidázy, které mohou inhibovat sekreci hlenu, jako je příklad EGF-LHN/C, mají potenciál pro vývoj jako terapeutické proteiny pro léčbu CHOPN, chronické bronchitidy, cystické fibrózy a dalších chronických respiračních stavů zahrnujících nadměrnou produkci hlenu v dýchacích cestách. Dlouhodobá aktivita proteinu by znamenala, že produkt by se musel inhalovat jen zřídka, což by jej činilo vhodným pro léčbu chronických respiračních onemocnění tohoto typu.

.