Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC) je geneticky heterogenní onemocnění způsobené zárodečnými mutacemi v jednom z několika genů MMR (Jiricny, 1998a,b), ačkoli současné důkazy naznačují, že většinu případů HNPCC tvoří zárodečné mutace v hMSH2 a hMLH1 (Peltomäki a Vasen, 1997). Nositelé genu HNPCC dědí mutaci v jedné z alel kódujících gen MMR a druhá kopie je mutována nebo ztracena jako časná událost při vývoji nádoru. Tato druhá událost způsobí, že buňky jsou deficientní v opravě chyb DNA (MMR), což pravděpodobně vede k rychlé akumulaci mutací, která je hnací silou rozvoje nádoru. Co přesně způsobuje základní predispozici ke kolorektálnímu karcinomu u jedinců s HNPCC, není dosud objasněno. Bylo prokázáno, že přesné sestavení lidských MMR komplexů je nezbytné pro účinnou MMR, aby byla zachována genomická integrita (Drummond et al., 1997). Tyto údaje naznačují, že v závislosti na povaze mutace v genech MMR a jejich expresi se složení a s ním i aktivita komplexů pro opravu DNA u jednotlivých jedinců HNPCC liší. Rovněž zapojení přinejmenším hMLH1 a hMSH2 do dalších buněčných drah, jako je rekombinace DNA a regulace kontrolního bodu buněčného cyklu (Jiricny, 1998a,b), které kontrolují stabilitu genomu, může být ovlivněno mutacemi v genech hMLH1 a hMSH2. Proto se vývoj nádoru a průběh onemocnění může u jednotlivých rodin HNPCC lišit (Jäger et al., 1997). Význam interakcí protein-protein v opravných komplexech podporují zjištění, že hMSH2 existuje v komplexu s hMSH6 (hMutSα) nebo hMSH3 (hMutSβ) a protein hMLH1 v komplexu s hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) nebo hMLH3 (Drummond et al., 1995; Li a Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). Bylo také prokázáno, že protein hMSH2 interaguje s lidskou exonukleázou 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Ačkoli není známo, zda se hEXO1 podílí na MMR, kmeny kvasinek s nedostatkem aktivity exonukleázy 1 vykazují zvýšenou míru spontánních mutací a malé zvýšení rekombinace, pokud heteroduplexní meziprodukt obsahuje neshody bází nebo malé smyčky (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Je známo, že jak exonukleáza 1 (EXO1), tak proteiny MMR se podílejí na homologní rekombinaci (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al., 1997) a že kvasinkový EXO1 hraje roli při opravě dvouřetězcových zlomů a meiotickém křížení (Tsubouchi a Ogawa, 2000).

Mnoho studií HNPCC se zaměřilo na identifikaci mutací v genech hMLH1 a hMSH2. Mutační analýza těchto genů však neurčuje molekulární a biochemické defekty, které jsou základem tohoto onemocnění. Pro lepší pochopení vztahu mezi ztrátou funkce genu hMLH1 a HNPCC jsme charakterizovali specifické protein-proteinové interakce komplexů hMutLα a hMLH1-hEXO1 pomocí mutantních forem hMLH1 nalezených u pacientů s HNPCC. Ke studiu těchto protein-proteinových interakcí in vivo a in vitro jsme použili kvasinkový dvouhybridní systém a také interakční test (pull-down) s glutathion S-transferázou (GST).

Bílkovina hMLH1 existuje převážně v komplexu s hPMS2 známém také jako heterodimer hMutLα (Li a Modrich, 1995). Tvorba komplexu hMutLα je nezbytná pro aktivitu MMR (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996), a proto by neschopnost proteinů HNPCC-hMLH1 tvořit komplex s hPMS2 mohla vést k neúčinné aktivitě MMR u jedinců s HNPCC. Abychom prozkoumali možnou příčinu, která je základem HNPCC, zkoumali jsme, zda tři mutanty hMLH1 identifikované u dánských pacientů s HNPCC (obrázek 1) jsou schopny interagovat s hPMS2. Mutace zahrnovaly missense mutaci threoninu na methionin na kodonu 117 (T117M) hMLH1 a dvě nové mutace HNPCC, nonsense mutaci (CAG na TAG) na kodonu 426 (Q426X) a frame-shift mutaci (vložení A na nukleotidu 1813) vedoucí k předčasnému zastavení na kodonu 609 (1813insA) (obrázek 1). Test pull-down s rekombinantními GST značenými proteiny HNPCC a in vitro transkribovaným a translovaným (IVTT) hPMS2 odhalil podle očekávání tvorbu komplexu mezi hMLH1 a hPMS2 (obrázek 2a, dráhy 5 a 10). Dále jsme zjistili tvorbu komplexu mezi HNPCC-hMLH1 (T117M) a hPMS2 (obr. 2a, dráha 11). Ačkoli jsme zjistili, že protein HNPCC-hMLH1 (T117M) je exprimován v eukaryotických buňkách NIH3T3 (údaje nejsou uvedeny), nepodařilo se nám reprodukovat interakci s hPMS2 v kvasinkovém dvouhybridním testu (obrázek 3a). Jedním z vysvětlení této nesrovnalosti by mohla být trojnásobně snížená tvorba komplexu mezi hPMS2 a mutantním proteinem HNPCC-hMLH1 (T117M) ve srovnání s proteiny hPMS2 a hMLH1, jak bylo kvantifikováno pomocí fosfoimageru (údaje nejsou uvedeny) (obr. 2a, dráhy 10 a 11). Naproti tomu komplexní formace mezi zkráceninami proteinu hMLH1, HNPCC-hMLH1 (Q426X) a HNPCC-hMLH1 (1813insA), a hPMS2 nebyly zjištěny v žádném z testů (obr. 2a, dráhy 12 a 13 a obr. 3a). V pull-down reakci obsahující HNPCC-hMLH1 (1813insA) a hPMS2 byl viditelný slabý pás (Obrázek 2a, dráha 13), ale jeho intenzita byla podobná pásu získanému v reakci obsahující pouze protein hPMS2 (Obrázek 2a, dráha 3), a proto je nepravděpodobné, že by představoval skutečný komplex mezi HNPCC-hMLH1 (1813insA) a hPMS2.

(a) Zarovnání sekvencí rodiny MutL. hMLH1: lidský homolog MutL hMLH1, yMLH1: homolog MutL Saccharomyces cerevisiae MLH1, MutL: MutL Escherichia coli. Konzervativní zbytky jsou vyznačeny tučným písmem. Zarovnání sekvencí bylo provedeno pomocí programu ClustalW Multiple Sequence Alignment. (b) Struktury proteinů hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminál, hEXO1a/HEX1-C-terminál a hEXO1b-C-terminál (Y5). Prostřednictvím dánského registru HNPCC byly identifikovány tři dánské rodiny s diagnózou HNPCC. V rodinách, které splňovaly amsterdamská kritéria, byly identifikovány dvě nové mutace HNPCC, nonsensová mutace (CAG na TAG) na kodonu 426 (Q426X) a frame-shift mutace (vložení A na nukleotidu 1813) vedoucí k předčasnému zastavení na kodonu 609 (1813insA) hMLH1. Třetí mutace, missense mutace threoninu na methionin v kodonu 117 (T117M) hMLH1, byla popsána již dříve (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). Kódující oblast hMLH1 byla klonována do místa EcoRI v pcDNA3 a použita jako templát pro mutagenezi zprostředkovanou primery ke konstrukci tří různých mutací HNPCC v hMLH1, T117M, Q426X a 1813insA. Sekvence DNA všech syntetických mutací a PCR-amplifikovaných fragmentů byla potvrzena sekvenováním DNA. Dalšími konstrukty použitými v této studii jsou hPMS2 (cDNA plné délky), HEX1-N (1355 bp N-koncové oblasti HEX1/hEXO1a), HEX1-C (1182 bp C-koncové oblasti HEX1/hEXO1a) a hEXO1b-C (Y5) (1952 bp C-koncové oblasti hEXO1b). Všechny konstrukty hEXO1 jsou podrobně popsány v Rasmussen et al., 2000)

GST fúzní proteinový test ke studiu interakce mezi proteiny hMLH1 a hEXO1b nebo hPMS2. (a) Pruh 1, označený protein IVTT hPMS2; pruh 2,+GST kuličky; pruh 3,+BL21 lyzát; pruh 4,+purifikovaný protein GST; pruh 5,+purifikovaný protein GST-hMLH1; pruh 6, purifikovaný protein GST-hMLH1 a označený vektor IVTT; pruh 7, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) a značený vektor IVTT; pruh 8, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) a značený vektor IVTT; pruh 9, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) a značený vektor IVTT; pruh 10, purifikovaný protein GST-hMLH1 a značený protein IVTT hPMS2; pruh 11, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) a značený protein IVTT hPMS2; pruh 12, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) a značený protein IVTT hPMS2; a pruh 13, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) a značený protein IVTT hPMS2. (b) Pruh 1, protein IVTT hEXO1b; pruh 2,+GST kuličky; pruh 3,+BL21 lyzát; pruh 4,+purifikovaný protein GST; pruh 5,+purifikovaný protein GST-hMLH1; pruh 6, purifikovaný protein GST-hMLH1 a značený vektor IVTT; pruh 7, purifikovaný protein GST-hMSH2 a značený protein IVTT hEXO1b; pruh 8, purifikovaný protein GST-hMLH1 a značený protein IVTT hEXO1b; pruh 9, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) a značený protein IVTT hEXO1b; pruh 10, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) a značený protein IVTT hEXO1b; a pruh 11, purifikovaný protein GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) a značený protein IVTT hEXO1b. Všechny reakce transkripčního překladu in vitro byly provedeny pomocí systému TNT spojeného s retikulocytárním lyzátem (Promega). Stručně řečeno, lyzáty byly inkubovány s 1 μg DNA, směsí aminokyselin bez cysteinu, 35S-cysteinem a T9 RNA polymerázou po dobu 90 min při 30 °C podle pokynů výrobce. Ke konstrukci GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) a GST-hMSH2 byl použit vektor pGEX (Pharmacia-Amersham). Všechny konstrukty pGEX jsou N-terminální GST-fúzní proteiny. Sekvenování DNA kompletní kódující oblasti potvrdilo všechny konstrukty. Fúzní proteiny byly purifikovány podle popisu Guerrette et al. (1998), s výjimkou použití neindukovaných kultur E. coli. Testy pull-down byly provedeny podle popisu Guerrette et al. (1998), s výjimkou inkubace proteinů po dobu 2 h při 30 °C předtím, než byly reakční směsi naloženy na gely

Interakce hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) a HNPCC-hMLH1 (1813insA) s hPMS2 nebo hEXO1 v kvasinkovém dvouhybridním systému. (a) Aktivita β-galaktosidázy, uvedená v Millerových jednotkách, byla stanovena podle popisu v Rasmussen et al. (2000). (b) a (c) Kmeny obsahující různé plazmidy byly rozetřeny na SD-LEU-TRP+X-gal destičky. Plazmidy obsažené v každém testovaném kmeni jsou uvedeny v horní části každého sloupce a v levé části každého řádku. AD: aktivační doména, BD: vazebná doména. Ke konstrukci fúzních proteinů GAL4 byly použity kvasinkové dvouhybridní vektory pAS2-1, pBRIDGE a pACT2 (CLONTECH). Kvasinkové dvouhybridní testy byly provedeny podle předchozího popisu (Rasmussen et al., 2000). Stručně řečeno, kódující oblasti hMLH1 nebo HNPCC-hMLH1 byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány do míst EcoRI a BamHI v pBRIDGE nebo do míst NcoI a BamHI v pACT2. hPMS2 byl amplifikován pomocí PCR s použitím pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) jako templátu a klonován do míst NdeI a BamHI v pAS2-1 a míst SmaI a EcoRI v pACT2. Všechny ostatní plazmidy jsou popsány v Rasmussen et al. (2000). Žádný z plazmidů nevykazoval interakci s dvouhybridními vektory bez insertu

Shodně bylo již dříve pomocí deleční mutageneze prokázáno, že interakce hMLH1 a hPMS2 je zprostředkována prostřednictvím C-koncové části hMLH1 (aminokyseliny 506-756) a C-koncové části hPMS2 (aminokyseliny 675-850) (obr. 1b) (Guerrette et al..), 1999). Mutace HNPCC-hMLH1 (T117M) byla zaznamenána v devíti nepříbuzných rodinách HNPCC z různých částí světa (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm a údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, jak již bylo prokázáno u kvasinek (Shcherbakova a Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998), že tato mutace není vázaným polymorfismem. Mutace HNPCC-hMLH1 (T117M) mapuje konzervovanou sekvenci (obrázek 1), o níž se předpokládá, že se přímo podílí na vazbě a/nebo hydrolýze ATP (Ban et al., 1999). Proto může missense mutace HNPCC-hMLH1 (T117M) inaktivovat aktivitu MMR tím, že změní schopnost tohoto mutantního proteinu vázat a/nebo hydrolyzovat ATP a s tím i tvorbu komplexů s jinými proteiny MMR. V souladu s touto hypotézou ukazujeme, že jedinci HNPCC nesoucí mutace HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) a HNPCC-hMLH1 (1813insA) mají narušenou tvorbu heterodimerů hMutLα, což vede k poruše aktivity MMR při ztrátě nebo inaktivaci druhé alely hMLH1.

Ve snaze identifikovat tkáňově specifické faktory asociované s MMR jsme my a další nedávno identifikovali lidskou exonukleázu, která interaguje s hMSH2 (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Prokázali jsme, že hMSH2 interaguje s oběma formami hEXO1, hEXO1b a hEXO1a/HEX1, a že tato interakce je zprostředkována jejich C-terminálními doménami. Naproti tomu jsme ve dvouhybridním systému nezjistili žádnou interakci mezi hMSH6 a hEXO1 (Rasmussen et al., 2000). Není známo, zda hEXO1 hraje roli v MMR nebo zda je jeho interakce s hMSH2 důležitá pro rekombinaci. Ukázali jsme, že protein hMLH1, stejně jako hMSH2, interaguje s oběma formami hEXO1 (hEXO1b a hEXO1a/HEX1) a že tato interakce je zprostředkována prostřednictvím C-terminálních domén exonukleáz (obr. 2b, dráhy 5 a 8 a obr. 3). Mezi hPMS2 a hEXO1 jsme nezjistili žádnou interakci (obr. 3a,c). Naše předběžné údaje naznačují, že přítomnost proteinů hMLH1 i hPMS2 nebránila vazbě hEXO1 na hMLH1 (údaje nejsou uvedeny). Proto se nedomníváme, že tvorba hMutLα nutně blokuje vazbu hEXO1 na hMLH1. Pro další charakterizaci interakce hMLH1 s hEXO1 jsme zkonstruovali fluorescenční proteinové fúze hMLH1 i hEXO1 a vnesli je do buněk NIH3T3 (obr. 4). Naše výsledky ukazují, že CFP-hMLH1 je přítomen především v jádře, ale část tohoto proteinu jsme detekovali také v cytoplazmě (obr. 4, panel 1). Naproti tomu YFP-hEXO1 detekujeme pouze v jádře (obrázek 4, panel 2). Při kotransfekci s YFP-hEXO1 byl však CFP-hMLH1 zcela jaderný (Obrázek 4, panely 3 a 4).

Jaderná lokalizace fúzních proteinů CFP-hMLH1 a YFP-hEXO1b. V den ošetření byly myší buňky NIH3T3 transientně transfekovány 3,5 μg CFP-hMLH1 (panel 1) nebo YFP-hEXO1b (panel 2) nebo oběma konstrukty (panely 3 a 4). Buňky byly inkubovány přes noc a následující den byla subcelulární lokalizace fúzních proteinů zkoumána konfokální laserovou skenovací mikroskopií. Transfekované buňky jsou navíc zobrazeny na odpovídajícím Nomarského obrázku. CDNA hMLH1 byla klonována do míst EcoRI a BamHI vektoru pECFP-C2 (CLONTECH) a cDNA hEXO1b byla klonována do míst BamHI a SalI vektoru pEYFP-C1 (CLONTECH). Oba fluorescenční proteinové konstrukty jsou N-koncové fúze

V souhrnu tyto výsledky ukazují, že nejméně dva proteiny MMR, konkrétně hMSH2 a hMLH1, interagují s lidskou exonukleázou 1, zatímco dva další proteiny MMR, hPMS2 a hMSH6, se přímo nepodílejí na interakci s hEXO1 při hodnocení v in vivo dvouhybridním testu.

Pro zjištění, zda interakce hMLH1 a hEXO1 mohou být u pacientů s HNPCC ovlivněny, byla charakterizována asociace tří výše popsaných mutantních proteinů hMLH1 s hEXO1. Pozitivní interakce byla prokázána pouze mezi HNPCC-hMLH1 (T117M) a plnou délkou proteinu hEXO1b pomocí in vitro pull-down testu (obr. 2b, dráha 9). Pomocí in vivo dvouhybridního testu však interakce protein-protein mezi proteiny HNPCC-hMLH1 a testovanými konstrukty exonukleázy 1 nebylo možné detekovat (obrázek 3). Interakce mezi plnou délkou hEXO1 fúzovanou s aktivační doménou GAL4 a proteiny hMLH1 jsme nemohli studovat, protože tyto konstrukty jsou v kvasinkovém dvouhybridním testu nefunkční (Rasmussen et al., 2000). Podobně jsme zjistili, že hMLH1 a deriváty hMLH1 fúzované s aktivační doménou GAL4 vedou k fúzním proteinům, které jsou nefunkční ve dvouhybridním testu (obrázek 3 a údaje nejsou uvedeny).

Závěrem naše výsledky ukazují, že tři nové mutace HNPCC-hMLH1, o nichž je známo, že se u pacientů s HNPCC kosegregují s náchylností k rakovině, vedou k defektu v sestavení heterodimeru hMutLα, který by mohl mít za následek sníženou aktivitu MMR. Podobně nejsou mutantní proteiny HNPCC-hMLH1 schopny interagovat ani s nově identifikovaným proteinem hEXO1, což je protein, který nyní zřejmě interaguje s hMLH1 a hMSH2, ale ne s hMSH6 a hPMS2. V současné době zůstávají přesné biologické cesty a celkový přínos těchto zdokumentovaných interakcí nejasné, a to především proto, že bylo zjištěno, že hMLH1 hraje roli jak v MMR, tak v rekombinaci. Pitvání molekulárních defektů u HNPCC pomocí testování patogenních proteinů MMR ve funkčních testech určených ke kvantifikaci interakcí v proteinových komplexech by mělo spolu s mutačním screeningem, imunohistochemií a analýzou mikrosatelitů pomoci při vývoji strategií pro diagnostiku a léčbu nositelů HNPCC.