Konstrukce plazmidu

Každý chimérický anti-HA scFv testovaný v této studii byl zkonstruován naroubováním šesti CDR smyček anti-HA protilátky 12CA5 na každý vybraný scFv scaffold. Plazmid \(\chi _{15{\mathrm{{F}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) byl zkonstruován ve dvou krocích: (1) gblok scFv naroubovaný na smyčku CDR a vektor H4K20me1 mintbody 15F1138 linearizovaný restrikčními místy EcoRI byly ligovány pomocí Gibsonovy montáže (master mix připravený společností House); (2) linker spojující scFv a EGFP, stejně jako EGFP, byl nahrazen gblokem kódujícím flexibilní (G4S) × 5 linker a mEGFP pomocí Gibsonovy montáže přes restrikční místa NotI. U ostatních čtyř chimérických plazmidů scFv byl každý gblock naroubovaný na smyčku CDR scFv ligován do vektoru \(\chi _{15{\mathrm{{F}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) linearizovaného restrikčními místy EcoRI prostřednictvím Gibsonovy montáže.

Cílový plazmid 1 × HA-mCh-H2B byl vytvořen nahrazením sfGFP z plazmidu Addgene sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) gblokem mCherry značeným epitopem 1 × HA, do kterého bylo vloženo restrikční místo NotI mezi epitop 1 × HA a mCherry pro následující klonování. 4 × HA-mCh-H2B byl sestrojen nahrazením 1 × HA značky 1 × HA-mCh-H2B konstruktu 4 × HA-epitopovým gblokem přes AgeI a NotI restrikční místa. Konstrukt 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) byl vytvořen nahrazením značky 1 × HA konstruktu 1 × HA-mCh-H2B značkou smHA amplifikovanou z plazmidu Addgene smHA-KDM5B-MS2 (Plasmid # 81085) pomocí primerů NZ-098 a 099 (všechny sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1). SmHA-H2B byl sestrojen nahrazením 1 × HA-mCh konstruktu 1 × HA-mCh-H2B amplifikovaným smHA z plazmidu smHA-KDM5B-MS2 pomocí primerů NZ-098 a 100.

Další cílový plazmid 4 × HA-mCh-β-actin byl sestrojen nahrazením H2B konstruktu 4 × HA-mCh-H2B amplikonem β-actinu přes restrikční místa BglII a BamHI. Amplikon β-aktinu byl amplifikován z plazmidu Addgene smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) pomocí primerů NZ-073 a NZ-074.

Plazmid 4 × HA-mRuby-Kv2.1 byl vytvořen tak, že se nejprve amplifikovala značka 4 × HA z 4 × HA-mCh-H2B pomocí primerů NZ-105 a 106.

Plazmid 4 × HA-mRuby-Kv2.1 byl vytvořen tak, že se nejprve amplifikovala značka 4 × HA z 4 × HA-mCh-H2B pomocí primerů NZ-106. Poté byl amplikon 4 × HA zaveden do publikovaného plazmidu pCMV-mRuby2-Kv2.161 (dar Dr. Michaela Tamkuna), který byl linearizován restrikčním štěpením pomocí AgeI, pomocí Gibsonova sestavení. Plazmid smHA-Kv2.1 byl vytvořen PCR amplifikací kódující sekvence potkaního Kv2.1 z pBK-Kv2.140 a následnou ligací do restrikčních míst AsiSI a PmeI na plazmidu smHA-KDM5B-MS2 pomocí primerů Kv2.1-1 a 2.

H2B-mCh-1 × HA byl zkonstruován dvěma kroky: (1) nahrazení značky 1 × HA z 1 × HA-mCh-H2B značkou H2B přes místa AgeI a NotI, přičemž H2B byl amplifikován z 1 × HA-mCh-H2B pomocí primerů NZ-092 a 093; (2) nahrazení H2B na C-konci mCherry značkou 1 × HA přes místa BglII a BamHI, přičemž značka 1 × HA byla syntetizována překrývající se PCR s primery NZ-094 a 095. Mito-mCh-1 × HA byl vytvořen nahrazením H2B v H2B-mCh-1 × HA gblokem Mito23 přes místa AgeI a NotI. Mito-mCh-smHA byl zkonstruován nahrazením značky 1 × HA v Mito-mCh-1 × HA značkou smHA amplifikovanou ze smHA-KDM5B-MS2 pomocí primerů NZ-096 a 097. mCh-H2B byl vytvořen nahrazením sfGFP z plazmidu sfGFP-H2B gblokem mCherry pomocí Gibsonovy montáže.

Plasmidy FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP byly vytvořeny nahrazením mEGFP z \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) gbloky mCherry, HaloTag a SNAP-tag.

pET23b-FB-GFP, plazmid pro rekombinantní expresi a purifikaci frankenbody, byl sestaven Gibsonem s amplikonem FB-GFP a publikovaným plazmidem pET23b-Sso7d62,63 linearizovaným restrikčními místy NdeI a NotI. Amplikon FB-GFP byl amplifikován z \(\chi _{15{\mathrm{{F}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) pomocí PCR s primery NZ-075 a 077.

Pro translační test byl reportérový konstrukt smHA-KDM5B-MS2 a SunTag-kif18b získán od společnosti Addgene (plazmid č. 81085 a č. 74928) a plazmid SunTag scFv (plazmid č. 60907) byl upraven odstraněním epitopu HA kódovaného v linkeru. Epitop HA byl odstraněn místně řízenou mutagenezí pomocí QuikChange Lightning (Agilent Technologies) podle pokynů výrobce s použitím primerů HAout-1 a 2.

Gbloky byly syntetizovány společností Integrated DNA Technologies a rekombinantní plazmidy byly sekvenčně ověřeny společností Quintara Biosciences. Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Všechny plazmidy použité pro zobrazovací translaci byly připraveny pomocí soupravy NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) s konečnou koncentrací přibližně 1 mg ml-1.

Buněčná kultura U2OS

Buňky U2OS (ATCC HTB-96) byly pěstovány v inkubátoru při 37 °C, zvlhčovány, s 5 % CO2 v médiu DMEM (Thermo Scientific) doplněném 10 % (v/v) fetálního hovězího séra (Altas Biologicals), 1 mM l-glutaminu (Gibco) a 1 % (v/v) penicilinu-streptomycinu (Gibco nebo Invitrogen).

Transfekce a nakládání kuliček

Pro sledování lokalizace proteinů byly buňky 2 dny před zobrazováním naneseny do 35mm komory MatTek (MatTek) a 18-24 h před zobrazováním byly transientně transfekovány pomocí činidla LipofectamineTM LTX s činidlem PLUS (Invitrogen) podle pokynů výrobce.

Pro zobrazování translace pomocí mRNA značené proteinem MCP-Halo byly buňky den před zobrazováním naneseny do 35mm komory MatTek (MatTek). V den zobrazování, před vložením kuliček, bylo médium v komůrce MatTek změněno na Opti-MEM (Thermo Scientific) s 10% fetálním hovězím sérem. Směs plazmidů (smHA-KDM5B-MS2/FB) a purifikovaného proteinu MCP-HaloTag17 byla naložena do kuliček, jak bylo popsáno dříve6,17,26 . Stručně řečeno, po odstranění média Opti-medium z komory MatTek byly na buňky pipetovány 4 µl směsi plazmidů (po 1 µg) a MCP-HaloTag (130 ng) v PBS a na ně byly rovnoměrně rozmístěny skleněné kuličky o velikosti ~ 106 µm (Sigma Aldrich). Poté se sedmkrát silně poklepalo na komůrku a k buňkám se opět přidalo Opti-medium. Po 3 hodinách od vložení kuliček byly buňky obarveny v 1 ml 0,2 nM ligandu JF646-HaloTag48 zředěného v kompletním DMEM bez fenolové červeně. Po 20minutové inkubaci byly buňky třikrát promyty v kompletním DMEM bez fenolu, aby se odstranily skleněné kuličky a nenavázaná barviva. Poté byly buňky připraveny k zobrazování.

Pro zobrazování translace bez značení mRNA byly buňky nanesené na komůrku MatTek v den zobrazování transientně transfekovány potřebnými plazmidy smHA-KDM5B-MS2/FB s nebo bez SunTag-kif18b/Sun (s odstraněným epitopem HA) pomocí činidla LipofectamineTM LTX s činidlem PLUS (Invitrogen) podle pokynů výrobce. Tři hodiny po transfekci bylo médium změněno na kompletní DMEM bez fenolu. Poté byly buňky připraveny k zobrazování.

Purifikace FB-GFP

Buňky E. coli BL21 (DE3) pLysS transformované pomocí pET23b-FB-GFP byly kultivovány při 37 °C na hustotu OD600 0,6 v médiu 2xYT obsahujícím Ampicilin (100 mg L-1) a Chloramfenikol (25 mg L-1) s třepáním. K indukci exprese proteinu byl přidán isopropyl-β-d-thiogalaktosid (IPTG) v konečné koncentraci 0,4 mM a teplota byla snížena na 18 °C. Po 16 h byly buňky sklizeny centrifugací a resuspendovány v PBS pufru doplněném 300 mM NaCl, inhibitory proteáz (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 ml L-1 kultury) a lyzovány sonikací. Lyzát byl vyčištěn centrifugací. Supernatant byl vložen na dvě spojené kolonky HisTrap HP 5 ml (GE Healthcare), promyt a eluován lineárním gradientem 0-500 mM imidazolu. Frakce obsahující POI byly sloučeny, zahuštěny pomocí centrifugační filtrační jednotky Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO (EMD Millipore) a vloženy na velikostně vylučovací kolonu HiLoad Superdex 200 PG (GE healthcare) v pufru na bázi HEPES (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glycerol a 1 mM DTT). Frakce obsahující protein FB-GFP byly shromážděny, zkoncentrovány a po bleskovém zmrazení tekutým dusíkem uchovávány při teplotě -80 °C.

Imunologické barvení

Buňky U2OS byly transientně transfekovány 4× HA-mCh-H2B nebo 4× HA-mCh-β-aktinem pomocí činidla LipofectamineTM LTX s činidlem PLUS (Invitrogen). 26 h po transfekci byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem (Electron Microscopy Sciences) po dobu 10 min při pokojové teplotě, permeabilizovány v 1% Tritonu 100 v PBS, pH 7,4 po dobu 20 min, blokovány v Blocking One-P (Nacalai Tesque) po dobu 20 min a barveny při 4 °C přes noc purifikovaným proteinem FB-GFP (0,5 µg ml-1 v 10% blokovacím pufru). Druhý den ráno byly buňky promyty PBS a POI byla zobrazena konfokálním mikroskopem Olympus IX81 s rotujícím diskem (hlava CSU22) pomocí objektivu s olejovou imerzí ×100 (NA 1,40) za následujících podmínek: (0,77 mW; měřeno v zadní ohniskové rovině objektivu; všechna měření laserového výkonu zde odpovídají zadní ohniskové rovině objektivu) a 561 nm (0,42 mW) sekvenční zobrazování pro 50 časových bodů bez zpoždění, rychlost otáčení 2 × 2, doba expozice 100 ms. Snímky byly pořízeny pomocí CCD kamery Photometrics Cascade II s použitím softwaru SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Snímky imunobarvení byly vytvořeny zprůměrováním snímků s 50 časovými body pro každý kanál pomocí Fiji64.

Western blots

Buňky U2OS byly transientně transfekovány 4 × HA-mCh-H2B nebo 4 × HA-mCh-β-actin pomocí činidla LipofectamineTM LTX s činidlem PLUS. Po 10 h po transfekci byly buňky sklizeny a lyzovány ve 120 µl pufru RIPA s inhibitorem cOmplete Protease Inhibitor (Roche). 6,5 µl každého buněčného lyzátu bylo naloženo na NuPAGETM 4-12% Bis-Tris proteinový gel (Invitrogen) a probíhalo 60 min při 100 V a 25 min při 200 V. Proteiny byly přeneseny na PVDF membránu (Invitrogen), blokovány v blokovacím pufru (5% sušené mléko v 0,05% TBS-Tween 20) po dobu 1 h a barveny přes noc buď purifikovaným proteinem FB-GFP (0,5 µg ml-1 v blokovacím pufru), nebo rodičovskou protilátkou anti-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; 2000násobné ředění s konečnou koncentrací 0,5 µg ml-1 v blokovacím pufru). Pro primární protilátku 12CA5 byla provedena dodatečná inkubace po dobu 1 h s protilátkou proti myším/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000násobné ředění v blokovacím pufru). POI byla detekována z fluorescence GFP pro FB-GFP nebo Alexa 488 pro protilátku anti-HA pomocí přístroje Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) s následujícími podmínkami: excitační vlnová délka 473 nm, filtr LPB (≥510 nm), fotonásobič 300 V a velikost pixelu 10 µm. Nekrácené a nezpracované western bloty jsou uvedeny na doplňkovém obr. 3.

Obnovení fluorescence po fotobleachingu

Pro studium vazebné afinity FB k epitopům HA v živých buňkách byly experimenty FRAP provedeny na buňkách transientně transfekovaných 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) a FB-GFP (1,25 µg) 24 h před FRAP. Snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Olympus IX81 s rotujícím diskem (hlava CSU22) spojeného s fotomanipulační jednotkou Phasor (Intelligent Imaging Innovations) s objektivem ×100 s olejovou imerzí (NA 1,40). Před fotobleachingem bylo získáno 20 nebo 10 snímků s časovým intervalem 1 nebo 5 s. Snímky byly pořízeny pomocí laseru o vlnové délce 488 nm (0,77 mW) s dobou expozice 100 ms a následně pomocí laseru o vlnové délce 561 nm (0,42 mW) s dobou expozice 15 ms. Rotující disk byl nastaven na rychlost otáčení 1 × 1. Po pořízení snímků před FRAP byl použit laser p488 nm (z jednotky Phasor pro fotobleaching) o výkonu 17 mW s dobou expozice 100 ms nebo 4 mW s dobou expozice 500 ms k fotobleachingu kruhové oblasti v jádře. Po fotobleachingu bylo pořízeno 30 snímků bez zpoždění nebo se zpožděním 500 ms a poté 100 snímků se zpožděním 1 s a 100 snímků se zpožděním 5 s za použití stejných obrazových nastavení jako u snímků před FRAP. Intenzita fluorescence v průběhu času fotobleachovaného místa byla exportována pomocí softwaru Slidebook. Intenzita fluorescence jádra a pozadí byla získána pomocí softwaru Fiji64 po korekci na pohyb buněk pomocí pluginu StackReg Fiji65. Křivka FRAP a thalf byly získány pomocí easyFRAP-web66 podle pokynů na webových stránkách. Obrázky 4b, d byly vytvořeny pomocí programu Mathematica (Wolfram Research).

PurifikaceMCP

MCP-HaloTag byl purifikován pomocí imobilizované kovové afinitní chromatografie17. Stručně řečeno, MCP-HaloTag značený His byl purifikován přes kolonu s Ni-NTA-agarosou (Qiagen) podle pokynů výrobce s drobnými úpravami. E. coli exprimující požadovaný protein byla lyzována v PBS pufru s kompletní sadou inhibitorů proteáz (Roche) a 10 mM imidazolem. Pryskyřice byla promyta pufrem na bázi PBS obsahujícím 20 a 50 mM imidazol. Protein byl poté eluován v pufru PBS s 300 mM imidazolem. Eluovaný MCP značený His byl dialyzován v pufru na bázi HEPES (10 % glycerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP-40 detergent a 1 mM DTT), zamrazen v tekutém dusíku a poté uložen při -80 °C.

Příprava buněk pro sledování vznikajících řetězců

Reportní plazmid smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plazmid #81085) a konstrukt FB byly buď transientně transfekovány bez proteinu MCP-HaloTag, nebo zatíženy kuličkami s proteinem MCP-HaloTag do buněk U2OS nanesených na 35mm komůrky MatTek 4-6 h před zobrazováním. O 3 h později, pokud byl protein MCP-HaloTag zatížen kuličkami, byly buňky obarveny ligandem JF646-HaloTag a poté promyty kompletním médiem DMEM bez fenolové červeně. Pokud nebyl protein MCP-HaloTag potřeba, bylo médium buněk 3 h po transfekci změněno na kompletní médium DMEM bez fenolu. Poté byly buňky připraveny k zobrazování.

Pro multiplexní zobrazování byly dva reportérové plazmidy, smHA-KDM5B-MS2 a SunTag-kif18b, stejně jako dvě sondy, FB-mCh a Sun-GFP (s odstraněným epitopem HA), transientně transfekovány do buněk U2OS nanesených na komůrku MatTek 4-6 h před zobrazováním. O 3 h později bylo médium buněk změněno na kompletní médium DMEM bez fenolu. Poté byly buňky připraveny k zobrazování.

Zobrazovací podmínky pro translační a kolokalizační testy

K zobrazování jednotlivých mRNA a stavu jejich translace pomocí FB byl použit fluorescenční mikroskop s širokým polem sestavený na zakázku na základě schématu šikmého osvětlení (HILO)17,67 . Stručně řečeno, excitační paprsky, pevnolátkové lasery 488, 561 a 637 nm (Vortran), byly spojeny a zaostřeny mimo osu na zadní ohniskovou rovinu objektivu (APON 60XOTIRF, Olympus). Všechny uváděné laserové výkony byly měřeny v zadní ohniskové rovině objektivu. Emisní signály byly rozděleny pomocí ultraplochého dichroického zrcadla zobrazovací třídy (T660lpxr, Chroma). Delší emisní signály (vzdáleně červené) byly po rozdělení propouštěny přes pásmový filtr (FF01-731/137-25, Semrock). Kratší emisní signály (červený a zelený) po rozdělení procházely buď pásmovým filtrem pro červenou barvu (FF01-593/46-25, Semrock), nebo pásmovým filtrem pro zelenou barvu (FF01-510/42-25, Semrock) instalovaným ve filtračním kolečku (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Delší (daleké červené) a kratší (červené a zelené) emisní signály byly detekovány dvěma samostatnými EM-CCD kamerami (iXon Ultra 888, Andor) zaostřením pomocí 300mm achromatického doublet objektivu (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Kombinace objektivu ×60 od společnosti Olympus, tubusu 300 mm a kamery iXon Ultra 888 vytváří snímky ×100 s rozlišením 130 nm pixel-1. Pro zobrazování živých buněk je na piezoelektrickém stolku (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) instalován inkubátor s horním pódiem pro teplotu (37 °C), vlhkost a 5 % CO2 (Okolab). Lasery, kamery, piezoelektrický stolek a filtrační kolečko byly synchronizovány pomocí open source mikrokontroléru, desky Arduino Mega (Arduino). Pořizování snímků se provádělo pomocí softwaru Micro-Manager s otevřeným zdrojovým kódem (1.4.22)68.

Velikost snímku byla nastavena na střed 512 × 512 pixelů2 (66,6 × 66,6 µm2) a integrační čas kamery byl nastaven na 53,64 ms. Doba čtení kamer z kombinace naší zobrazovací velikosti, režimu čtení (30 MHz) a rychlosti vertikálního posunu (1,13 µs) byla 23,36 ms, což vedlo k naší zobrazovací frekvenci 13 Hz (70 ms na snímek). Červené a zelené signály byly zobrazovány střídavě. Poloha emisního filtru se měnila během doby čtení kamery. Aby se minimalizovalo prosakování, byl vzdálený červený signál zobrazován současně se zeleným signálem. Pro zachycení celé tloušťky buněk bylo pomocí piezoelektrického stolku zobrazeno 13 z-stacků s velikostí kroku 500 nm (celkem 6 µm). Tím jsme dosáhli celkové frekvence zobrazování buněk 1 Hz pro zobrazování červeného nebo zeleného signálu a 0,5 Hz pro zobrazování červeného i zeleného signálu bez ohledu na zobrazování vzdáleného červeného signálu.

Na obr. 1c, d, 2a, e byla jedna rovina buněk zobrazována nepřetržitě při frekvenci 6,5 Hz po dobu 100 časových bodů a zprůměrována po celou dobu (lasery: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (obr. 1c), 90 µW (obr. 1d), 19 µW (obr. 2a), 155 µW (obr. 2e); 637 nm, 220 µW). Pro obr. 2b (vlevo) byla buňka zobrazována kontinuálně při frekvenci 0,5 Hz, lasery 488 nm (100 µW) a 561 nm (10 µW) s 13 z-stacks v každém časovém bodě a průměrována po celou dobu. Získaných zprůměrovaných 13 z-stacků bylo dekonvolvováno pomocí Fiji. Na obr. 6b, c, e a f byly buňky snímány každých 10 s s 13 z-stacks v každém časovém bodě (lasery: 488 nm, 13 µW (obr. 6b), 18 µW (obr. 6c); 561 nm, 172 µW (obr. 6f); 637 nm, 150 µW (obr. 6b, c), 35 µW (obr. 6e)). Na obr. 7b byla buňka zobrazována nepřetržitě při frekvenci 0,5 Hz s 13 z-stacks v každém časovém bodě (lasery: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Na obr. 8b byly buňky snímány každých 14 s s 13 z-stacks v každém časovém bodě (laser: 488 nm, 70 µW). Na obr. 8c byly buňky snímány každých 40 s s 13 z-stacks v každém časovém bodě (laser: 488 nm, 130 µW). Pro stanovení rychlosti motorických translačních skvrn (obr. 8e) byly neurony snímány kontinuálně při frekvenci 1 Hz s 13 z-stacks v každém časovém bodě.

Pro obr. 2b (vpravo) a 2c byla kolokace snímána pomocí dříve popsaného konfokálního mikroskopu Olympus IX81 s rotujícím diskem (hlava CSU22) s použitím objektivu s olejovou imerzí ×100 (NA 1,40) za následujících podmínek: Při sekvenčním zobrazování 488 nm (0,77 mW) a 561 nm (0,42 mW) pro pět časových bodů bez prodlevy s více z řezy, aby bylo pokryto celé buněčné tělo pro každý časový bod, rychlost otáčení 1 × 1, doba expozice upravená podle jasu buněk. Snímky byly získány pomocí CCD kamery Photometrics Cascade II s použitím softwaru SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Zobrazené snímky na obrázcích byly vytvořeny zprůměrováním pěti časových bodů a poté byla provedena maximální projekce všech z-řezů pomocí programu Fiji64.

Sledování částic translačních míst

Detekce a sledování jednotlivých translačních míst byla provedena na snímcích s projekcí maximální intenzity pomocí vlastního kódu Mathematica (Wolfram Research)17 . Stručně řečeno, snímky byly zpracovány pásmovým filtrem pro zvýraznění částic a poté binarizovány pro detekci jejich středů intenzity jako pozic pomocí vestavěné rutiny Mathematica ComponentMeasurements. Detekované částice byly sledovány a propojeny v čase pomocí vyhledávání nejbližšího souseda. Přesné souřadnice (superrezolvované polohy) mRNA a translačních míst byly určeny fitováním (pomocí vestavěné rutiny Mathematica NonlinearModelFit) původních obrazů na 2D Gaussovy obrazy následujícího tvaru:

kde IBG je fluorescence pozadí, I intenzita částic, (x0, y0) umístění částic a (σx, σy) rozptyl částic. Posun mezi oběma kamerami byl registrován pomocí vestavěné rutiny programu Mathematica FindGeometricTransform k nalezení transformační funkce, která nejlépe zarovnává přizpůsobené polohy kuliček Tetraspeck o průměru 100 nm rovnoměrně rozložených v zorném poli obrazu.

Na obr. 6c, e, f, 7c, 8b, d byly částice sledovány pomocí vlastního kódu programu Mathematica a dále vykresleny pomocí programu Mathematica. Pro obr. 7c byly průměrné střední kvadratické posuny vypočteny z Gaussovsky fitovaných souřadnic (z 2D snímků s projekcí maximální intenzity). Difuzní konstanta byla získána fitováním prvních pěti časových bodů na přímku se sklonem m = 4D, kde D je difuzní koeficient. Jednotlivé motorické translační body (obr. 8e) byly po maximální projekci sledovány pomocí zásuvného modulu Fiji TrackMate69 a dále vykresleny pomocí programu Mathematica. Veškerý kód programu Mathematica je k dispozici na vyžádání.

Sledování jednotlivých molekul 1×HA značených proteinů v buňkách

Den před zobrazováním byly buňky naneseny na komůrku MatTek a transientně transfekovány 1× HA-mCh-H2B a FB-Halo pomocí činidla LipofectamineTM LTX s činidlem PLUS (Invitrogen) podle pokynů výrobce. Po 3 hodinách od transfekce bylo médium změněno na kompletní DMEM. Před zobrazením byly buňky obarveny pomocí Halo ligandu TMR ošetřeného borohydridem sodným (NaBH4) (Promega)45 . Stručně, 1 µl 1 mM barviva Halo ligand TMR byl redukován po dobu 10 min ve 200 µl 50 mM roztoku NaBH4 (předem rozpuštěného v PBS po dobu 10 min, pH 7,4). Poté bylo 200 µl redukovaného TMR zředěno 800 µl DMEM bez fenolové červeně, čímž vznikl 1 ml redukovaného média TMR. Médium z transfekovaných buněk bylo nahrazeno redukovaným médiem TMR a buňky byly poté umístěny do inkubátoru (5 % CO2, 37 °C) na 30 min pro barvení. Poté byly buňky třikrát promyty DMEM bez fenolové červeně. Mezi jednotlivými promytími byly buňky inkubovány po dobu 5 min v inkubátoru (5 % CO2, 37 °C).

Buňky byly zobrazeny pomocí vlastního fluorescenčního mikroskopu se širokým polem založeného na schématu šikmého osvětlení (HILO)17,67 . Zobrazovací zorné pole bylo nastaveno na 256 × 256 pixelů2 (33,3 × 33,3 µm2) a doba integrace kamery byla nastavena na 30 ms. Buňky byly zobrazovány laserem o výkonu 7,7 mW a vlnové délce 561 nm při zobrazovací frekvenci 43,8 ms na snímek pro celkem 10 000 časových bodů (7,3 min). Během zobrazování byl jednou za 10 s na 50 ms zapnut 6,2 mW 405 nm laser, aby se fotoaktivoval redukovaný ligand Halo-TMR. Jednotlivé molekuly byly sledovány pomocí pluginu Fiji TrackMate69. Aby bylo zajištěno, že stopy představují FB-Halo navázaný na 1 × HA-mCh-H2B, byly stopy dále filtrovány v programu Mathematica. Filtr odstranil stopy o délce menší než 16 snímků. Dále musely být všechny skoky mezi snímky menší než 220 nm. Toto kritérium použili jiní k rozlišení transkripčních faktorů vázaných na chromatin od nevázaných46. Nakonec byly v programu Mathematica stopy barevně označeny buď podle času, kdy byly získány (jako na doplňkovém obr. 5), nebo podle průměrné velikosti skoků mezi snímky (jako na obr. 5).

Ošetření puromycinem

Buňky U2OS transientně transfekované smHA-KDM5B-MS2 a FB nebo s kuličkami naloženými smHA-KDM5B-MS2, FB a MCP-HaloTag byly zobrazeny, jak je uvedeno výše, s intervaly 10 s mezi snímky. Po pořízení 5 nebo 10 časových bodů jako snímků před ošetřením byly buňky ošetřeny konečnou koncentrací 0,1 mg ml-1 puromycinu těsně před pořízením 6. nebo 11. časového bodu. Po přidání puromycinu byly buňky snímány za stejných podmínek jako při snímání před ošetřením, dokud translační skvrny nezmizely.

Kultivace neuronů a transfekce

Kortikální neurony potkanů byly získány z vyřazené kůry plodů embryonálního dne (E)18, které byly předtím pitvány za účelem získání hipokampu, a zmrazeny v médiu Neurobasal (ThermoFisher Scientific) obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (FBS, Atlas Biologicals) a 10 % dimetylsulfoxidu (Sigma-Aldrich, D8418) v tekutém dusíku. Kryoprezervované krysí kortikální neurony byly naneseny v hustotě ∼15 000-30 000 buněk na cm2 na misky MatTek (MatTek) a kultivovány v médiu Neurobasal obsahujícím 2% doplněk B27 (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanin/l-glutamin a 1% FBS (Atlas Biologicals). Transfekce byly provedeny po 5-7 dnech v kultuře pomocí přípravku Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) podle pokynů výrobce. Neurony koexprimující 4× HA-mRuby-Kv2.1 a FB-GFP byly zobrazeny 1-2 dny po transfekci (obr. 2b). Neurony koexprimující smHA-Kv2.1 a FB-GFP byly zobrazeny 1-7 dní po transfekci (doplňkový obr. 2 vlevo). Pro testy translace byly neurony zobrazeny 4-12 hodin po transfekci. Všechny experimenty se zobrazováním neuronů byly prováděny v prostředí s řízenou teplotou (37 °C), zvlhčováním vzduchu a 5 % CO2 v médiu Neurobasal bez fenolové červeně (ThermoFisher Scientific). Identita neuronů byla potvrzena sledováním procesů vycházejících z těla zobrazované buňky na vzdálenost stovek mikrometrů, aby se zajistilo, že se jedná o skutečné neurity.

Monitorování vývoje zebřiček

Všechny experimenty se zebřičkami byly schváleny Výborem pro bezpečnost genetických experimentů Tokyo Tech (I2018001) a manipulace se zvířaty probíhá v souladu s pokyny. Pro vizualizaci FB-GFP v embryu zebřičky byly připraveny mRNA pro FB-GFP a N × HA-mCh-H2B. Fragmenty DNA kódující FB-GFP a N × HA-mCh-H2B byly vloženy do plazmidu obsahujícího promotor T7 a poly A70. Následné plazmidy (T7-FB-GFP a T7-N × HA-mCh-H2B) byly linearizovány restrikčním místem XbaI pro in vitro transkripci pomocí soupravy mMESSAGE mMACHINE (ThermoFisher Scientific). RNA byla přečištěna pomocí RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) a resuspendována ve vodě. Před mikroinjekcí byla vajíčka zebřiček (AB) dechorionizována namočením do 2 mg ml-1 pronázy (Sigma Aldrich; P5147) v 0,03% mořské soli po dobu 10 minut. Směs (~0,5 nL) obsahující mRNA (po 200 pg pro FB-GFP a N × HA-mCh-H2B) byla vstříknuta do žloutku (v blízkosti buněčné části) embryí ve stadiu 1 buňky. Pro negativní kontrolu byla mRNA HA-mCh-H2B vynechána. 5 až 10 minut po injekci mRNA byla injikována Fab značená Cy5 specifická pro endogenní acetylaci histonu H3 Lys9 (CMA310)25 (100 pg v ~0,5 nL). Injektovaná embrya byla inkubována při 28 °C do čtyřbuněčného stadia a zalita do 0,5% agarózy (Sigma Aldrich, A0701) v 0,03% mořské soli s živočišným pólem dolů na 35mm misce se skleněným dnem (MatTek). Fluorescenční snímky byly pořízeny pomocí konfokálního mikroskopu (Olympus; FV1000) vybaveného vyhřívaným stolkem (Tokai Hit) nastaveným na 28 °C a silikonovým olejovým imerzním objektivem UPLSAPO ×30 (NA 1,05), který byl ovládán vestavěným softwarem FV1000 FLUOVIEW ver.4.2. Tři barevné snímky byly pořízeny postupně každých 5 minut pomocí laserů 488, 543 a 633 nm (640 × 640 pixelů; 0,662 μm pixel-1, pinhole 800 μm; 2,0 μs pixel-1) bez průměrování. Projekce s maximální intenzitou byly vytvořeny z 20 z-stacků po 5 μm.

Jádra v embryích zebřiček byla sledována ve 4D pomocí pluginu Fiji TrackMate69. Výsledky byly následně zpracovány a vykresleny pomocí programu Mathematica. Pro kvantifikaci počtu a plochy jader a průměrné jaderné, cytoplazmatické a jaderně:cytoplazmatické intenzity v čase byla změřena intenzita všech jader v projekcích s maximální intenzitou pomocí vestavěné funkce Mathematica ComponentMeasurements. Funkce ComponentMeasurements vyžaduje binární masky měřených objektů. Binární masky jader byly vytvořeny pomocí vestavěné funkce Mathematica Binarize s vhodným prahem intenzity pro zvýraznění právě jader v obrazech z Fab značených Cy5 (specifických pro endogenní acetylaci histonu H3 Lys9). Masky cytoplazmy kolem jednotlivých jader byly vytvořeny rozšířením jaderných masek o 4 pixely (pomocí vestavěného příkazu Dilation) a následným odečtením od rozšířené masky původní jaderné masky rozšířené o 1 pixel. Tím se kolem každého jádra vytvoří prstencové masky, z nichž se změřila průměrná intenzita cytoplazmy.

Povrchová plazmonová rezonance

Kinetika vazby purifikovaného FB na epitopovou značku HA se měřila pomocí povrchové plazmonové rezonance (OpenSPR, Nicoyalife). Po zachycení biotinem značeného peptidu HA senzorovým čipem se streptavidinem (Nicoyalife) byl zředěný purifikovaný FB-GFP v běžícím pufru PBS, pH 7,4, pomalu přeléván přes senzorový čip po dobu 5 min, aby došlo k interakci. Poté se tekoucí pufr nechal protékat po dobu 10 min, aby se shromáždily údaje o disociaci. Křivka nespecifické vazby byla získána průtokem stejné koncentrace FB-GFP ve stejném tekoucím pufru přes jiný streptavidinový senzorový čip (Nicoyalife). Údaje z kontroly byly shromážděny přesně jako v experimentu. Pro 100 a 30 nM FB-GFP byla vazebná odezva výrazně vyšší než u kontroly, přičemž nespecifická vazebná interakce byla zanedbatelná. Proto jsme pro fitování vazebné kinetiky zvolili tyto dvě koncentrace. Po odečtení kontroly byla získána křivka závislosti signální odezvy na čase, jak je znázorněno na doplňkovém obr. 4. Kinetické parametry vazby byly získány fitováním křivky na vazebný model jedna ku jedné pomocí softwaru TraceDrawer (Nicoyalife) (Doplňkový obr. 4).

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary spojené s tímto článkem.

.