Rychlá proteinová kapalinová chromatografie (FPLC) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC): dvě kapalinové chromatografické metody v přímém srovnání. Tento článek se zabývá rozdíly mezi oběma technikami se zvláštním důrazem na požadavky příslušných analytů.
Názvy rychlá proteinová kapalinová chromatografie (FPLC) a vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) nabízejí nápovědu k rozdílům mezi těmito chromatografickými metodami. Zatímco HPLC pracuje s vysokým tlakem při analýze malých chemických sloučenin, FPLC čistí velké biomolekuly, jako jsou proteiny nebo DNA. Chromatografie biomolekul je velmi náročná a citlivá, protože nesnesou vysoké teploty, vysoké tlaky ani rozpouštědla, která se obvykle používají při HPLC. Z těchto důvodů vyžaduje separace biomolekul alternativní přístup k HPLC.
Pro rychlou kapalinovou chromatografii proteinů se běžně používá několik termínů, například biochromatografie, bioseparace nebo biopurifikace. Tato speciální forma chromatografie se používá k purifikaci velkých biomolekul o velikosti několika kilodaltonů (kDa), jako jsou proteiny, nukleotidy nebo peptidy (obrázek 1). Cílem uživatele FPLC je získat co nejčistší a nativní produkt. Naproti tomu cílem klasické HPLC je identifikovat a kvalifikovat analyty, obvykle malé sloučeniny o velikosti od několika atomů do přibližně 3000 Da.
Úkol získat čistý protein z buněčného extraktu
Typicky se biomolekuly purifikují z bakteriálních nebo eukaryotických buněk, které jsou plné proteinů, DNA, RNA a buněčných membrán. Proto může být purifikace požadovaného proteinu z buněčného extraktu velmi náročná. Biochemici používají několik triků: jedním z nich je použití rekombinantních proteinů, které jsou buňkami nadměrně exprimovány. Nadměrná exprese zájmového proteinu umožňuje purifikaci ve větším množství. Druhým trikem je přidání značky k proteinu zájmu, který je specificky rozpoznáván pryskyřicí (materiálem kolony). Proteiny bez značky se na kolonu nenavážou a okamžitě eluují, zatímco požadovaný protein je obohacen a může být snadno separován.
Biomolekuly se purifikují z buněčných lyzátů, což znamená mnohem větší objemy vzorků než při analytické HPLC. Proto se k nástřiku vzorku používají větší vzorkovací smyčky nebo dokonce čerpadla s vyššími průtoky. Kromě toho se materiály kolon FPLC a HPLC zcela liší. Pro HPLC se používají křemenné kuličky s velmi malou velikostí částic a s velkou odolností vůči vysokým tlakům, zatímco FPLC vyžaduje pro většinu metod agarosový nebo polymerní materiál s větší velikostí částic. Pryskyřice používané pro FPLC nejsou tak tlakově stabilní jako křemenné kuličky a jsou velmi citlivé na vzduchové bubliny. Kromě toho se liší nejen materiál kolony, ale také její vybavení. V klasické HPLC se používají tlakově odolné kolony z nerezové oceli. Jak již bylo uvedeno, pro FPLC není tlaková stabilita důležitá, a proto je možné pracovat s průhlednými a biokompatibilními skleněnými kolonami. To je velká výhoda, protože uživatel může během purifikačního běhu kontrolovat, zda na koloně nejsou vzduchové bubliny, nebo sledovat stav materiálu.
Různé biomolekuly, různé metody purifikace
Rozdíly v materiálu kolon se odrážejí také v metodách. V analytické HPLC je metodou volby chromatografie s obrácenými fázemi s hydrofobními stacionárními fázemi a polárními mobilními fázemi, zatímco v FPLC se používá větší množství metod (obrázek 2). Jednou z metod FPLC je velikostně vylučovací chromatografie (SEC), při níž jsou molekuly separovány podle své velikosti. Menší molekuly mohou difundovat do pórů kuliček, zatímco větší molekuly procházejí kolonou téměř nezachyceny. Menší molekuly se z kolony eluují později a vytvářejí gradient těchto molekul podle jejich velikosti. Další separační metodou je iontově výměnná chromatografie. Biomolekuly jsou separovány a purifikovány podle svého specifického náboje, který závisí na pH pufru. Čím více je protein nabitý, tím lépe se váže na opačně nabitou pryskyřici. Pro eluci proteinu z kolony se během běhu zvyšuje koncentrace solných iontů. Ionty soli soutěží s proteinem o vazbu na pryskyřici. Další důležitou metodou FPLC je afinitní chromatografie, kdy se molekula zájmu může specificky vázat na kolonu, zatímco ostatní molekuly nikoli a eluují se bez vazby. Zde se používají kolony se speciálními médii, která rozpoznávají požadovanou biomolekulu. Zvláštní formou afinitní chromatografie je imobilizovaná afinita kovových iontů (IMAC). Zájmový protein musí být geneticky upraven přidáním značky k proteinu, která se obvykle skládá ze šesti histidinů. Pryskyřice IMAC tento „Hisâtag“ specificky rozpoznává. Eluce probíhá zvýšením koncentrace imidazolu, který konkuruje proteinům s Hisovým značením. Kromě toho lze proteiny separovat také podle jejich specifické hydrofobicity pomocí metody separace hydrofobními interakcemi. Pryskyřice je složena tak, aby se nejsilněji hydrofobní proteiny vázaly na kolonu a byly eluovány snižováním gradientu soli.
Pro purifikaci požadovaného proteinu se obvykle používá kombinace metod. V prvním kroku, takzvaném „záchytném“ kroku, se protein purifikuje ze surového extraktu. Pro tento první krok purifikace se obvykle používá afinitní chromatografie. Ve druhém kroku, tzv. mezikroku, se další kontaminace odstraní pomocí iontově výměnné chromatografie nebo hydrofobní interakce. Cílem závěrečného „leštícího“ kroku – obvykle velikostně vylučovací chromatografie – je zbavit se všech zbývajících nečistot a získat produkt vysoké čistoty. Tato strategie čištění proteinů zcela závisí na konkrétní biomolekule. V některých případech může stačit dvoustupňové čištění. Čím více metod se kombinuje, tím více zájmového proteinu se během čištění ztratí, ale lze dosáhnout vyšší čistoty.
Po přečištění lze získaný vzorek analyzovat z hlediska čistoty, koncentrace a funkce nebo aktivity enzymu pomocí HPLC, polyakrylamidové gelové elektroforézy s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE), testů aktivity enzymu nebo hmotnostní spektrometrie.
Požadavky na FPLC
Proteiny se skládají z aminokyselin seřazených do řetězce. Tento řetězec je složen do trojrozměrné struktury, která je klíčem k funkci a aktivitě každého proteinu. Proto je velmi důležité zachovat tuto strukturu bílkovin během procesu purifikace. Vnější faktory, jako je vysoká teplota, vysoký tlak, extrémní pH nebo rozpouštědla, mohou narušit strukturu proteinu, a proto se jim při FPLC vyhýbáme. Pracovní teplota pro proteiny je obvykle 4 °C. Proto je zařízení FPLC často umístěno v chladné komoře nebo chladné místnosti, kde je vystaveno nejen nízké teplotě, ale také kondenzující vlhkosti. Součásti systému FPLC musí být pro tyto podmínky speciálně navrženy. Kromě toho se komponenty FPLC setkávají s další výzvou, a to s fyziologickými pufrovacími roztoky, které se používají jako eluenty. Obvykle se volí izosmotické pH a koncentrace solí podobné prostředí buněk. Chromatografické systémy jsou obvykle vyrobeny z nerezové oceli. Na jedné straně může sůl v pufrech vést ke korozi a na druhé straně mohou kovové ionty z nerezové oceli interferovat s proteinem a narušovat jeho strukturu. Proto je důležité se při provádění FPLC vyhnout nerezové oceli a použít biokompatibilní materiál, jako je keramika z polyether ether ketonu (PEEK) nebo titan. Stejně jako systémy HPLC jsou i systémy FPLC řízeny softwarem. Mezi softwarem pro FPLC a HPLC existují značné rozdíly. Ten druhý slouží především k analýze vzorků a obsahuje množství analytických nástrojů. V případě FPLC však není mnoho analytických nástrojů potřeba a je běžné generovat metody na základě objemu nebo dokonce objemu kolony (obr. 3). Pro většinu aplikací FPLC se upřednostňují metody založené na objemu kolony, což usnadňuje rozšiřování. Software FPLC je většinou velmi intuitivní a uživatelsky přívětivý a zahrnuje přímé ovládání, které umožňuje úpravy parametrů během běhu. Uživatel tak může velmi spontánně reagovat na různé situace.
Je tedy zřejmé, že mezi těmito dvěma chromatografickými oblastmi existují velké rozdíly (tabulka 1). Metody, hardware a software se značně liší v závislosti na tom, zda se molekula analyzuje, nebo purifikuje. U aplikací FPLC přispívá k náročnosti citlivá povaha vzorků a ambice udržet je co nejnativnější. Celkově lze říci, že obě techniky jsou velmi zajímavou oblastí, o které by měl vědět každý, kdo v této oblasti pracuje.
Stephanie Runde vystudovala biochemii na Technické univerzitě v Mnichově v Německu. Doktorát získala na Freie Universität Berlin, Německo, a v současné době pracuje ve společnosti Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH jako produktová manažerka pro FPLC.