V posledním desetiletí způsobily chemogenetické a optogenetické techniky revoluci v integrativní neurovědě tím, že poskytly nové nástroje pro reverzibilní manipulaci s aktivitou specifických populací nebo neurotransmiterových systémů s větší selektivitou (Sternson a Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Ve srovnání s optogenetikou, která umožňuje rychlou a fázovou modulaci neuronů s vysokým časovým rozlišením, umožňuje chemogenetika rozsáhlejší modulaci systémů, což je užitečné zejména pro studie zaměřené na tonické jevy (např. zkoumání vlivu dopaminu na motivační procesy; Whissell et al., 2016). Mezi chemogenetickými nástroji se hojně využívají designérské receptory aktivované výhradně designérskými drogami (DREADD), které jsou označovány jako biologický systém „zámku a klíče“ pro selektivní manipulaci buněčné aktivity prostřednictvím signálních drah G-proteinů. Poprvé je velmi elegantně vyvinula Rothova skupina (Armbruster et al., 2007), tento receptor spřažený s G-proteinem (GPCR) je muskarinový receptor: zámek, který byl mutován tak, aby reagoval pouze na klozapin-N-oxid (CNO), klíč, odvozený metabolit atypického antipsychotika klozapinu, jinak potenciálně bez farmakologické aktivity.

Od roku 2016 se však v některých publikacích objevily znepokojivé otázky týkající se použití CNO. Zaprvé, relativně vysoké dávky CNO (10 mg/kg) podávané systémově mohou mít farmakologickou necílovou aktivitu, o čemž svědčí indukce behaviorálních účinků u potkanů a myší, které nejsou zprostředkovány DREADD (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Gomez et al. navíc (2017) ukázali, že CNO nepřekračuje snadno hematoencefalickou bariéru, může vykazovat nízkou vazebnou afinitu k DREADD a byl zpětně metabolizován na klozapin, který se stal skutečným efektorem DREADDs. Na základě těchto nápadných pozorování navrhli přímé použití nízkých dávek klozapinu (0,1 mg/kg) k aktivaci DREADDs místo CNO. Použití nízkých dávek klozapinu namísto velkých dávek CNO postupně přecházejících na klozapin však vede ke dvěma zásadním omezením. Zaprvé není zřejmé, zda klozapin při akutní injekci nebo dlouhodobé difúzi působí na DREADDs stejným způsobem (Mahler a Aston-Jones, 2018). Za druhé, protože klozapin je atypické antipsychotikum, má četné endogenní cíle, jako jsou serotoninergní, muskarinové nebo dopaminergní receptory, s relativně silnou afinitou (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby a Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) a je pravděpodobné, že i při nízkých dávkách vyvolá účinky mimo cíl. Bylo totiž zjištěno, že dávka 0,1 mg/kg klozapinu doporučená pro experimenty s DREADD významně zvyšuje chování související s úzkostí u myší (Manzaneque et al., 2002) i u potkanů (účinek, který jsme pozorovali i my; R. Goutaudier a S. Carnicella, nepublikovaná pozorování), kde klozapin rovněž ovlivňuje lokomoci prostřednictvím potenciální sedace a zhoršuje kognitivní flexibilitu (Ilg et al.), 2018).

Ačkoli výskyt těchto účinků může záviset na použitém druhu, kmeni nebo pohlaví a může být velmi diskrétní (protože nejsou ovlivněny všechny dimenze chování), mají potenciál významně narušit výkonnost zvířat v různých behaviorálních úkolech. Vysoký stres a úzkost mohou být matoucími faktory například ve studiích paměti nebo bolesti (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Kromě toho může chování související se zneužíváním drog nebo psychiatrickými poruchami, jako je schizofrenie, úzkost nebo kognitivní flexibilita, modifikovat celý fenotyp (Floresco et al., 2009; Koob a Schulkin, 2018). Na základě těchto pozorování jsou u klozapinu nutná důležitá opatření, aby se zabránilo zkreslení behaviorálních studií.

Byla by nová molekula určená speciálně pro DREADD selektivnější? Sloučenina 21 (C21) je syntetický ligand DREADD vyvinutý v roce 2015 (Chen et al., 2015) a částečně charakterizovaný in vitro i in vivo v roce 2018 (Thompson et al., 2018). Opět bylo popsáno, že v nízkých dávkách (<3 mg/kg) postrádá behaviorální off-target účinky a je schopen změnit chování zvířat exprimujících DREADD. Tuto studii posílili Jendryka et al. (2019), kteří provedli farmakokinetické a farmakodynamické experimenty s použitím myší a C21 (3 mg/kg). Ukázali, že 30 minut po podání C21 byla koncentrace molekuly v CSF >10krát vyšší než odhadované EC50 pro aktivaci DREADD (CSF = 40 nm a EC50DREADDs = 3 nm), a to bez zpětné metabolizace na klozapin. Výsledky nedávné preprintové studie BioRxiv na potkanech, myších a makacích (Bonaventura et al., 2018) však naznačují, že ačkoli C21 vykazuje nízkou penetraci do mozku, již dávka 1 mg/kg může modifikovat mozkové funkce u myší divokého typu. Kromě toho byla pozorována slabá afinita a obsazenost pro DREADDs in vitro v mozkových řezech potkanů a také in vivo u myší a makaků ve studii pozitronové emisní tomografie. Na základě stejného experimentálního šetření jako u C21 navrhli jako alternativu dva další ligandy, JHU37152 a JHU37160, které mají vyšší účinnost in vivo pro DREADDs a potenciálně méně off-target efektů (Bonaventura et al., 2018). Ačkoli se tato nová generace ligandů DREADD jeví jako slibná, vzhledem ke své novosti jsou stále nedostatečně charakterizovány a zůstávají strukturně homologní s klozapinem a CNO. Vyčerpávající charakterizace v buněčném až behaviorálním výzkumu bude proto zásadní pro vyloučení potenciálních úskalí zjištěných u CNO.

Alternativním řešením pro zlepšení selektivity chemogenetických přístupů by bylo použití jiné kombinace zámku a klíče. Jako takový je κ-opioidní receptor-DREADD (KORD), což je mutovaný inhibiční GPCR odvozený od lidského κ-opioidního receptoru (Vardy et al., 2015). Ve srovnání s klasickými DREADD, které vážou klozapin, CNO, C21 nebo sloučeniny JHU, je KORD zapojen salvinorinem B, metabolitem podobným léčivu selektivního agonisty KOR salvinorinu A. Ačkoli byl tento chemogenetický přístup elegantně použit v kombinaci s aktivačním DREADD k vytvoření systému „ON a OFF“ v rámci stejné populace neuronů (Vardy a kol, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), zůstává využíván jen okrajově, protože snižuje aktivitu neuronů pouze po krátkou dobu (Aldrin-Kirk a Björklund, 2019). Salvinorin B navíc ve vysokých koncentracích vykazuje určitou afinitu k endogennímu KOR a zatím se mu nedostalo hloubkové charakterizace, jaká se v současnosti provádí u sloučenin souvisejících s DREADD (Roth, 2016). Nahrazení GPCR mutovaným iontovým kanálem, dalším alternativním navrženým receptorem nazývaným ligandem řízené iontové kanály (LGIC), je možnost vyvinutá laboratoří Stenson (Magnus et al., 2011). Ve srovnání s DREADD kombinují LGIC doménu vázající ligand mutovaného nikotinového receptoru s doménou iontového póru jiného vybraného receptoru a vytvářejí tak chimérický iontový kanál. Podobně jako u DREADD je tento hybridní kanál aktivován malým agonistou odvozeným od chinuklidinylbenzamidu, agonisty α7 nikotinového acetylcholinového receptoru, a umožňuje výměnu iontů přes neuronální membránu. Kromě jiných omezení specifických pro tento přístup (Aldrin-Kirk a Björklund, 2019) sdílí s DREADDs také použití farmakologického ligandu, který může potenciálně interagovat s endogenními receptory v závislosti na experimentálních podmínkách. A konečně, všechny tyto zámky vycházejí z endogenních receptorů a jako takové se nedokážou zbavit omezení, která jsou neodmyslitelně spojena s farmakologií.

Přes tento nedávný vývoj a zbývající otázky je třeba si položit zásadní otázku: Bude někdy nalezen zcela selektivní a inertní klíč? Pravděpodobně ne. Je nezbytné mít na paměti, že DREADD jsou chemogenetické nástroje kombinující genetiku a farmakologii. Ačkoli genetické přístupy nabízejí výkonnou kontrolu exprese zámků (tj. DREADD) ve specifických buněčných populacích nebo subpopulacích s podmíněnými přístupy, pocházejí z endogenních GPCR a jako takové podléhají stejným omezením jako klasická farmakologie pro klíč. Je proto nepravděpodobné, že budou nalezeny molekuly, které budou vykazovat vysokou vazebnou afinitu k DREADDs bez afinity k některému z četných receptorů, které jsou již v mozku přítomny a jsou s DREADDs úzce příbuzné. Například klozapin má velmi vysokou afinitu k DREADDs, ale také k serotoninergnímu receptoru 5-HT2 (Ki = 10-8 pro oba; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017) a vysokou afinitu k široké škále dalších GPCR (Ki = 10-7 až 10-6; Armbruster et al., 2007). I syntetické ligandy, které jsou speciálně navrženy pro tuto chemogenetickou techniku, vykazují značnou afinitu k endogenním receptorům. Například ačkoli JHU37152 a JHU37160 mají nižší afinitu k receptorům 5-HT než klozapin, mají celkově podobný cílový profil jako toto léčivo, s ještě vyšší afinitou k muskarinovým receptorům (Bonaventura et al., 2018), což naznačuje potenciálně silnější účinky mimo cíl. C21 také vykazuje vyšší afinitu k histaminergnímu H1 receptoru než k DREADD (Ki > 10-8, respektive Ki = 10-7,2; Thompson et al., 2018) a větší vazebný potenciál k opioidním receptorům než klozapin (Bonaventura et al., 2018). Aby se minimalizovala úskalí tohoto účinného přístupu, je třeba bez ohledu na volbu klíče přijmout kritická opatření (obr. 1).

Před každým behaviorálním experimentem je třeba nejprve otestovat experimentální podmínky, abyste našli nejlepší ligand a optimální dávku nebo dávky v závislosti na experimentálním přístupu. DREADD nelze považovat za nástroj na klíč; před behaviorální studií by měly být provedeny buněčné, neurochemické nebo elektrofyziologické experimenty (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016), aby se potvrdila účinnost ligandu ve zvolené dávce v zájmovém systému. Kromě toho je třeba zahrnout také kontrolní zvířata bez DREADD, aby se ověřila nepřítomnost aspecifických neurobiologických účinků ligandu nebo receptoru jako takového, který může být aktivován neurotransmiterem nebo mít konstitutivní aktivitu (Saloman et al., 2016).

Druhé, pokud je to možné, je třeba testovat dva různé ligandy DREADD, aby se potvrdilo, že pozorované behaviorální účinky jsou specificky zprostředkovány DREADD. Specifické farmakologické účinky na DREADD by byly podobné, ale účinky mimo cíl se mohou lišit.

Zatřetí, a to je nejkritičtější bod, je třeba použít konvenční farmakologické kontroly. Měla by se uplatňovat stejná filozofie jako ve farmakologii a stejně jako u neurobiologických experimentů musí být začleněny skupiny transgenních zvířat bez exprese DREADDs (např. DREADDs prázdné virové vektory), aby se ověřily selektivní účinky ligandu a zvolené dávky (Smith et al., 2016, Campbell a Marchant, 2018; Mahler a Aston-Jones, 2018; příklad experimentálních studií podle tohoto designu viz také Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Toto tvrzení se může zdát triviální, ale snaha o absolutně selektivní ligand a atraktivita tohoto přístupu již vedly k některým příliš sebevědomým behaviorálním studiím, někdy prováděným za úplné absence této kontroly.

Závěrem lze říci, že DREADD poskytují přesný způsob manipulace s nervovými obvody a chováním a poskytují skvělou alternativu k optogenetice pro tonickou manipulaci se specifickou buněčnou subpopulací, čímž otevírají nové vzrušující cesty výzkumu. Nicméně stejně jako tepelné vlastnosti světla v optogenetice mohou vést k aspecifickým účinkům (viz také Owen et al., 2019), je u chemogenetiky nutná větší opatrnost a standardní kontroly musí být povinné. Je třeba si uvědomit omezení DREADD a věnovat čas tomu, aby se předešlo možným necílovým účinkům nebo aby se tyto účinky kontrolovaly a aby se ověřilo, že tento přístup sám o sobě nevyvolává zkreslení. Využití silných stránek genetiky a zároveň věnování pozornosti slabým stránkám farmakologie maximalizuje potenciál tohoto přístupu.

.