Optimalizace testu IFN-γ ELISpot po stimulaci PBMC antigeny T-activated® IE-1 a pp65 CMV

Pro test ELISpot byly použity čerstvě izolované PBMC. Aby se zabránilo ztrátě funkčnosti T buněk, například v důsledku aktivovaných granulocytů , byly heparinizované vzorky krve zpracovány bez dalších přísad během 8 h. Pro vývoj protokolu testu ELISpot byl zvolen celkový počet 2 × 105 PBMC na jamku, protože tento počet buněk je nižší než konfluence a lze jej obvykle získat ze vzorků méně než 15 ml plné krve. Bezprostřední raný protein CMV IE-1 a pozdní tegumentový protein pp65 představují dobře charakterizované imunodominantní antigeny T-buněk. Plná délka IE-1 a 181 aminokyselinový C-koncový fragment pp65 byly vyrobeny a formulovány v přítomnosti močoviny (T-activation®), aby se zvýšila jejich stimulační schopnost pro různé typy efektorových buněk CMV zprostředkované imunity . Optimální koncentrace antigenu T-activated® byla nejprve stanovena provedením experimentů s odezvou na dávku. Čerstvě izolované PBMC jednoho zdravého CMV-seropozitivního dárce byly stimulovány 31,6 fg/ml až 31,6 μg/ml T-activated® pp65 nebo 0,01 až 31,6 μg/ml T-activated® IE-1 a počet buněk vylučujících IFN-γ byl stanoven pomocí IFN-γ ELISpot. T-aktivovaný® pp65 vykazoval mnohem silnější schopnost stimulovat efektorové buňky vylučující IFN-γ než T-aktivovaný® IE-1, přičemž dosáhl vrcholu reaktivity mezi 0,316 a 3,16 ng/ml pp65 oproti přibližně 31,6 μg/ml pro IE-1 (obr. 1). V souladu s tím byly pro další stimulaci PBMC a testy ELISpot vybrány koncentrace antigenu T-activated® 3 μg/ml pp65 a 15 μg/ml IE-1.

Senzitivita a specificita testu byly stanoveny stimulací PBMC izolovaných vždy od 10 CMV-seropozitivních a CMV-seronegativních zdravých dárců definovanými koncentracemi antigenu pp65 a IE-1 T-activated®. Počet reaktivních efektorových buněk byl kvantifikován pomocí IFN-γ ELISpot. Významná stimulace byla definována pomocí Mannova-Whitneyho U-testu jako statisticky významný rozdíl mezi hodnotami SFC nestimulovaných a CMV antigenem stimulovaných podmínek (vždy ve čtyřnásobném opakování). T-activated® pp65 a IE-1 vyvolaly významnou aktivaci citlivých efektorových buněk u 10 z 10 a 9 z 10 přípravků PBMC od jednotlivých CMV-seropozitivních dárců (obr. 2). V tomto kolektivu vykazoval T-aktivovaný® pp65 celkově větší schopnost aktivovat citlivé buňky s mediánem 399 SFC/200 000 PBMC (rozmezí 12-864 SFC/200 000 PBMC) ve srovnání s T-aktivovaným® IE-1 s mediánem 26 SFC/200 000 PBMC (rozmezí 1,3-96 SFC/200 000 PBMC). Nicméně u jednotlivých vzorků CMV-seropozitivních dárců byla zjištěna významná odpověď až 96 SFC/200 000 PBMC v reakci na T-aktivovaný® IE-1 (obr. 2). Všech 10 vzorků PBMC (100 %) od různých CMV-seronegativních dárců vykazovalo po stimulaci pp65 negativní výsledky testu (medián 0,3 SFC/200 000 PBMC; rozmezí 0-2,8), zatímco 9 z 10 (90 %) vzorků PBMC od CMV-seronegativních jedinců bylo po stimulaci IE-1 negativních (medián 2,9 SFC/200 000 PBMC; rozmezí 0,3-6,8). Počet skvrn v rámci CMV-seronegativních PBMC stimulovaných IE-1 byl vyšší než u CMV-seronegativních PBMC stimulovaných pp65, ale nepřesáhl 7 SFC/200 000 PBMC (obr. 2).

Bylo prokázáno, že IFN-γ je během stimulace antigenem vylučován kontinuálně. Intenzita signálu v ELISpotu IFN-γ je tedy závislá na délce stimulace . Doba trvání stimulace antigenem u IFN-γ ELISpot uváděná v literatuře se obvykle pohybuje od 16 do 24 h . Abychom se zabývali vlivem doby inkubace na výsledky testu, byly provedeny testy IFN-γ ELISpot na PBMC od 3 nezávislých CMV-seropozitivních zdravých dárců po stimulaci antigeny T-activated® pp65 a IE-1 po dobu 17, 19 a 21 h. Mezi těmito 3 podmínkami nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly v počtu SFC (obr. 3), což prokazuje stabilitu signálu v tomto časovém rozmezí. Proto byla pro optimalizovaný test ELISpot zvolena inkubační doba 19 h.

Výsledky testu ELISpot může ovlivnit řada proměnných protokolu. Například médium používané pro primární buněčné kultury často obsahuje sérum, které obsahuje různé šaržově závislé necharakterizované bioaktivní molekuly v různých koncentracích . Za účelem definování standardizovaných podmínek kultivace buněk byl zkoumán vliv různých médií obsahujících sérum (RPMI 1640 doplněné 5 % buď FCS, lidského AB, syntetického NTA nebo syntetického NTS) a médií bez séra (AIM-V®, UltraCulture) na výkon testu. Bezsérová média poskytla nejlepší efektorové buněčné odpovědi, srovnatelné s RPMI 1640 doplněným 5 % FCS (obr. 4a). AIM-V® navíc vykazoval nejnižší signály pozadí v nestimulovaných podmínkách (obr. 4b), čímž maximalizoval poměr signál/šum. Proto byl protokol ELISpot dále zaveden s použitím média AIM-V® bez séra.

ELISpot testy lze provádět s různými membránovými materiály, včetně nitrocelulózy (NC), směsného esteru celulózy (MCE) a polyvinylidenfluoridu (PVDF). Porovnali jsme výsledky IFN-γ ELISpot ze vzorků PBMC šesti zdravých jedinců (po čtyřech opakováních, dva preparáty od každého dárce) s použitím nejčastěji používaných destiček MCE, destiček PVDF a proužků PVDF od společnosti Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Německo). PVDF membrány vyžadují před navázáním záchytné protilátky aktivaci ethanolem. Kromě toho byly při použití destiček na bázi PVDF ve srovnání s destičkami MCE nutné přísnější promývací kroky před vyvoláním skvrny, aby se zabránilo nežádoucímu zabarvení pozadí membrán. Nicméně rozlišení detekovaných skvrn z hlediska ostrosti a homogenity bylo na PVDF membránách lepší (není uvedeno), což vedlo k vyššímu počtu skvrn ve srovnání s MCE membránami (až 10krát více v případě stimulace IE-1, s mediánem SFC 155 vs. 13/200 000 PBMC; obr. 5). Protože proužky PVDF s 8 jamkami byly výkonnější a protože jejich použití by mohlo umožnit snížení nákladů, zejména při rutinním testování vzorků od jednoho pacienta, byl pro vývoj optimalizovaného testu zvolen formát PVDF s 8 jamkami.

Optimální potažení mikrotitračních destiček záchytnou protilátkou má zásadní význam pro robustní provedení testu. Hustota záchytné protilátky IFN-γ navázané na PVDF membránu by neměla být limitující a zejména by měla umožnit spolehlivou detekci vysokého počtu skvrn. PVDF proužky byly potaženy zvyšujícími se koncentracemi (2,5 až 7,5 μg/ml) protilátky proti IFN-γ. Proužky PVDF byly potaženy zvyšujícími se koncentracemi (2,5 až 7,5 μg/ml). PBMC od pěti CMV-seropozitivních dárců byly nasazeny do potažených jamek a buď ponechány bez stimulace, nebo stimulovány T-aktivovaným® IE-1 nebo pp65. V rozmezí 2,5 až 7,5 μg/ml neměla zvyšující se koncentrace protilátky žádný vliv na barvení pozadí u nestimulovaných PBMC (medián SFC 0 až 0,5/200 000 PBMC bez ohledu na koncentraci zachycující protilátky IFN-γ; obr. 6a-b). Podobně byly nízké až střední hladiny SFC specifické pro IE-1 (mediány 19 až 26 SFC/200 000 PBMC) srovnatelné ve všech podmínkách potahování protilátkou (obr. 6a). Totéž platilo pro pp65 specifické odpovědi až do ~300 SFC/200 000 PBMC (dárci d032, d120 a d241; obr. 6c). Naopak u jednotlivých dárců s vyšším počtem míst (např. d172, d202; obr. 6c) se detekce pp65-reaktivních buněk zvyšovala v závislosti na dávce s koncentrací záchytné protilátky IFN-γ použité k potažení, zejména mezi 2,5 a 5 μg/ml protilátky. Při koncentraci protilátky 5 μg/ml a vyšší zůstával počet skvrn stabilní (obr. 6b-c). Na základě těchto výsledků byla pro potahování v optimalizovaném protokolu ELISpot zvolena koncentrace 5 μg/ml záchytné protilátky IFN-γ.

ELISpot testy jsou založeny na detekci zachyceného cytokinu pomocí cytokinově specifických protilátek, které mohou být buď přímo spojeny s reportérovým enzymem (jednostupňový vývoj testu), jako je alkalická fosfatáza (AP), nebo kombinací biotinylované sekundární protilátky a reportérového enzymu konjugovaného se streptavidinem (dvoustupňový vývoj testu). Jednostupňový vývoj testu šetří čas při manipulaci a zabraňuje chybám obsluhy. Jako detekční konjugát pro standardizovaný protokol ELISpot byla použita mAb konjugovaná s AP (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Německo). Byly testovány různé parametry inkubace (např. 0,5 – 3 h při 37 °C, 2 h při pokojové teplotě). Počty skvrn byly za všech podmínek srovnatelné. Morfologie skvrn, a tedy správná detekce, však byla nejlepší při inkubaci s konjugátem AP po dobu 2 h při RT ve srovnání s ostatními podmínkami (není uvedeno). Zvýšení koncentrace detekčního konjugátu z 0,025 na 0,4 U/ml vedlo k mírně zvýšeným hodnotám mediánu SFC pro pp65 a maximální počty skvrn převýšily hodnoty vytvořené při dvoustupňovém vývoji testu (není uvedeno). Proto byl zvolen jednostupňový vývoj testu po dobu 2 h při RT s detekčním konjugátem 0,4 U/ml.

K dokončení optimalizace testu byla nakonec řešena standardizace reakce barvení SFC. Doba inkubace se substrátem AP ovlivňuje velikost skvrny a/nebo úroveň pozadí, a je tedy rozhodující pro spolehlivé stanovení počtu skvrn. Jako barvicí roztok byl použit jednostupňový chromogenní substrát alkalické fosfatázy NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) a byla hodnocena doba inkubace v rozmezí od 2 do 13 min ve tmě. Počty SFC byly za všech podmínek srovnatelné. Kratší inkubační doba však vedla k menšímu průměru skvrn, zatímco delší inkubační doba vedla ke zvýšení úrovně pozadí (údaje nejsou uvedeny). Proto byla pro optimalizovaný protokol ELISpot stanovena doba barvení 6 minut ve tmě.

Linearita a přesnost optimalizovaného testu CMV ELISpot

Optimalizovaný protokol ELISpot byl použit ke stanovení pracovního rozsahu PBMC, který zajišťuje linearitu testu. PBMC od jednoho zdravého CMV-seropozitivního dárce byly nasazeny v hustotě od 2 × 104 do 2,5 × 105 PBMC na jamku. Pro počty buněk mezi 6 × 104 a 2 × 105 PBMC na jamku byly počty ELISpotů přímo úměrné počtu nasazených PBMC po stimulaci buď IE-1 (lineární regresní analýza; R2 = 0,97), nebo pp65 (R2 = 0,99) (obr. 7a). Vzhledem k obvykle nižšímu počtu skvrn v důsledku stimulace IE-1 bylo pro standardizovaný test ELISpot zvoleno použití 2 × 105 PBMC na jamku, aby byly zajištěny dostatečné hodnoty SFC.

Pro další ověření linearity mezi počtem CMV-reaktivních efektorových buněk a vyčísleným SFC byly nasazeny rostoucí počty PBMC od jednoho CMV-seropozitivního zdravého dárce a celkový počet PBMC byl upraven na 2 x 105 na jamku pomocí PBMC od jednoho CMV-seronegativního dárce. Pro tyto experimenty byly vybrány dva páry dárců (d034 + d219, d204 + d067), které nevykazovaly žádnou aloreaktivitu v 19hodinové společné kultuře. Vzhledem k nízkému počtu SFC (pod 20 SFC/200 000 PBMC) vykazovaly výsledky stimulace IE-1 zvýšenou variabilitu ve srovnání s pp65 a neumožnily spolehlivý výpočet linearity (hodnoty R2 pod 0,96; údaje nejsou uvedeny). Výsledky testu ELISpot po stimulaci pp65 vykazovaly dobrou lineární korelaci pro oba páry dárců s hodnotami R2 0,99 (d034 + d219) a 0,98 (d204 + d067) v lineární regresní analýze (obr. 7b).

Přesnost a opakovatelnost optimalizovaného testu byla hodnocena výpočtem variability uvnitř testu, mezi testy, mezi operátory a mezi pracovišti. V každém případě byly PBMC od tří CMV-seropozitivních zdravých dárců testovány ve čtyřech opakováních a variabilita byla hodnocena výpočtem variačního koeficientu (CV), definovaného jako poměr směrodatné odchylky k průměru. CV pro hodnoty ELISpot < 10 SFC/200 000 PBMC nebyl počítán (viz výpočet hranice pozitivity níže). CV v rámci testu dosáhlo 14 % pro stimulaci IE-1 a 6 % pro stimulaci pp65 (Additional File 1: Table S1). CV mezi testy nepřesáhlo 17 % pro IE-1 a 22 % pro pp65 (Additional File 1: Table S2). CV mezi operátory bylo nižší než 13 % pro IE-1 a 18 % pro pp65 (Additional File 1: Table S3). Nakonec byla vyhodnocena variabilita mezi jednotlivými pracovišti, která je nezbytná pro validaci testu pro diagnostické účely. Vzorky plné krve byly současně odebrány od tří CMV-seropozitivních zdravých dárců a odeslány (za konstantních podmínek při RT) do čtyř různých laboratoří v Německu. PBMC byly čerstvě izolovány a testy ELISpot byly provedeny podle optimalizovaného protokolu celkem 7 operátory. CV mezi jednotlivými pracovišti dosáhlo maximálně 39 % pro IE-1 a 28 % pro pp65 (Additional File 1: Table S4).

Pro dosažení statisticky významných výsledků ELISpot bylo doporučeno vyhodnocení nejméně čtyř nezávislých měření . Abychom se zabývali vlivem variací uvnitř opakování na výsledek testu, porovnali jsme výsledky ELISpot z pětinásobného a čtyřnásobného měření každé kontroly a stimulace antigenem. Nebyly zjištěny žádné významné odchylky výsledků testu (údaje nejsou uvedeny). Čtyřnásobná měření nestimulovaných a T-aktivovaných® IE-1 a pp65 stimulovaných podmínek proto umožňují spolehlivost testu a také praktičnost v kombinaci s použitím 8jamkových proužků.

Stafylokokový enterotoxin B (SEB) je silný superantigen a fytohemaglutinin (PHA) silný mitogen, oba vyvolávají masivní sekreci IFN-γ T-buňkami . SEB a PHA jsou tedy vhodnými pozitivními kontrolami životaschopnosti buněk, úspěšné stimulace sekrece cytokinů a celkové funkčnosti T buněk. To je zvláště důležité pro interpretaci výsledků, pokud se očekává nízká frekvence T buněk, například u příjemců alogenní transplantace kmenových buněk. V optimalizovaném testu ELISpot se stimulace testovaných vzorků buď SEB, nebo PHA provádí duplicitně.

K ověření správného provedení testu byla navíc zavedena kontrola operátora nezávislá na efektorových buňkách. Tato operátorská kontrola je založena na detekci rekombinantního IFN-γ po přímé inkubaci s imobilizovanou záchytnou protilátkou anti-human-IFN-γ mAb (1-D1K). Tato kontrola, rovněž prováděná ve dvou opakováních, by měla přinést homogenní tmavé zbarvení membrány PVDF.

Technická validace testu: definice mezní hodnoty pozitivity

Pro usnadnění interpretace výsledků testu IFN-γ ELISpot a maximalizaci specifičnosti (tj. zamezení falešně pozitivních výsledků v rámci nestimulovaných podmínek a v rámci stimulovaných podmínek u CMV-seronegativních jedinců) byla definována technická mezní hodnota. Testy IFN-γ ELISpot byly provedeny podle optimalizovaného protokolu na PBMC od 45 zdravých dárců, z nichž 32 bylo CMV IgG-seropozitivních (tabulka 1).

Medián a rozsah hodnot SFC z nestimulovaných PBMC CMV-seronegativních a CMV-seropozitivních jedinců byly srovnatelné . Počty skvrn v IE-1- a pp65-stimulovaných PBMC CMV-seronegativních jedinců byly nízké . U CMV-seropozitivních jedinců dosahovaly hodnoty SFC v IE-1- a pp65-stimulovaných PBMC 1114 a 954 skvrn/200 000 PBMC (medián 22 a 265; obr. 8). Pro stanovení technické hranice byly vzaty v úvahu počty skvrn v nestimulované kontrole i v T-aktivovaných® pp65- a IE-1-stimulovaných podmínkách CMV-seronegativních a CMV-seropozitivních jedinců. Práh pozitivity byl stanoven pomocí z-statistiky (hladina α = 0,05) na log10-transformovaných geometrických průměrných hodnotách. Hodnoty = 0 byly nahrazeny hodnotami blízkými detekčnímu limitu, který byl považován za 0,5. Směrodatná odchylka (SD) měření ELISpot pro nestimulovanou kontrolu, stimulaci IE-1 a stimulaci pp65 byla 0,234, 0,192 a 0,136 v uvedeném pořadí. Při uvažování SD 0,2 a za předpokladu, že pro každou negativní kontrolu a testované vzorky jsou měřeny 4 replikáty, bylo vypočteno kritérium, že poměr geometrických průměrů stimulovaných a nestimulovaných hodnot je alespoň 2,5. Na druhé straně byly z výsledků testů specifických pro IE-1 i pp65 vytvořeny profily přesnosti, přičemž jako mez přijatelnosti platnosti testu pro stanovení příslušné meze stanovitelnosti (LoQ) byl použit variační koeficient (CV) nejvýše 40 %. Profily přesnosti pro výsledky ELISpot specifické pro IE-1 a pp65 od 45 zdravých dárců poskytly hodnoty LoQ 8,6 a 7,1 (doplňkový soubor 2). Za zmínku stojí, že podobná analýza provedená na souboru 124 hemodialyzovaných pacientů poskytla srovnatelné hodnoty SD v rámci nestimulovaných a antigenem stimulovaných podmínek (rozmezí 0,199-0,240) a poskytla hodnoty LoQ 7,8 (IE-1) a 8,3 (pp65) . Na základě těchto analýz byla pro definování pozitivních výsledků testu zvolena mezní hodnota 10 SFC/200 000 PBMC.

Souhrnně, při použití antigenů T-activated® pp65 a IE-1 a optimalizovaného testu IFN-γ ELISpot jsou výsledky testu považovány za pozitivní, pokud je geometrický průměr skvrn vzniklých stimulací pp65 nebo IE1 ≥ 10 SFC/200 000 PBMC a pokud je poměr geometrických průměrů stimulovaných a nestimulovaných podmínek ≥ 2.5. Podle těchto definic prokázal kolektiv 45 zdravých dárců (32 CMV IgG-seropozitivních, 13 CMV IgG-seronegativních) senzitivitu (definovanou jako pozitivní shodu s CMV IgG-serologií, použitou jako primární referenční postup měření) 97 % a specificitu (negativní shodu s CMV IgG-serologií) 85 % (obr. 8).

Validace funkčního testu: T-aktivované antigeny stimulují široké spektrum klinicky relevantních efektorových buněk reagujících na CMV

Močovinou formulované rekombinantní (T-aktivované®) proteiny jsou zpracovávány jak exogenními (MHC třídy II), tak endogenními (MHC třídy I) cestami zpracování a prezentace antigenů . Stimulace PBMC pomocí T-aktivovaných® proteinů tak přesněji reprodukuje přirozenou infekci, což může vést k aktivaci širokého spektra klinicky relevantních CMV-reaktivních buněk (např. Th, CTL, NK, NKT buněk; ), což může přispět k vysoké citlivosti testu IFN-γ ELISpot. K další charakterizaci buněk, na které jsou cíleny T-aktivované® IE-1 a pp65 antigeny, a ke zkoumání možné interindividuální variability v odpovědi efektorových buněk bylo souběžně s testy IFN-γ ELISpot provedeno intracelulární barvení IFN-γ a analýzy průtokovou cytometrií. Čerstvě izolované PBMC od šesti CMV-seropozitivních zdravých dárců byly stimulovány T-aktivovanými® proteiny IE-1 a pp65 po dobu 19 hodin a buňky produkující IFN-γ byly sčítány podle optimalizovaného testu ELISpot. Stejné přípravky PBMC (každý ve 4 opakováních) byly stimulovány po dobu 6 h stejnou dávkou proteinů T-activated® IE-1 a pp65 v přítomnosti ko-stimulačních protilátek anti-CD28 a anti-CD49d. Povrchové markery (CD3, CD4, CD8, CD56) a intracelulární barvení IFN-γ byly analyzovány průtokovou cytometrií, jak je popsáno v části Metody. IFN-γ+ subpopulace CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-like) a CD3-CD56+ (NK) lymfocytů byly spočítány podle strategie gatingu znázorněné v doplňkovém souboru 3. Všech šest dárců se lišilo ve schopnosti vyvolat odpověď závislou na IE-1 a/nebo pp65 v testu IFN-γ ELISpot. Intenzita odpovědi byla mezi šesti dárci také různorodá, s hodnotami od 7 do 1 054 SFC (stimulace IE-1) a od 28 do 780 SFC (stimulace pp65) na 200 000 PBMC (obr. 9a). Podobně se jednotliví dárci lišili ve frekvenci a poměru různých buněčných subpopulací vyšetřovaných pomocí průtokové cytometrie (obr. 9b). Je zajímavé, že zdraví CMV-seropozitivní jedinci s nižším počtem skvrn (d120, d300, d343; obr. 9a) vykazovali také nižší frekvence IFN-γ+ lymfocytů pomocí průtokové cytometrie (obr. 9b), což zdůrazňuje schopnost testu ELISpot rozlišit nízké a vysoké respondéry. Aktivace každé zkoumané subpopulace lymfocytů byla zjištěna u některých, ale ne u všech dárců. Například slabá až silná aktivace CD4+ T buněk byla zjištěna u 4 ze 6 dárců (d120, d172, d300, d343) v reakci buď na IE-1, pp65, nebo na obojí. Podobně 5 ze 6 dárců (d172, d290, d300, d343, d361) vykazovalo aktivaci CD8+ T buněk při jedné nebo obou stimulačních podmínkách. CD3-CD56+ (NK buňky) byly patrné u jednoho dárce (d120) v reakci na oba antigeny. CD3+CD56+ (NKT-like) buňky byly slabě aktivovány u 4 ze 6 jedinců (d120, d172 d300, d361) v odpovědi na IE-1 i pp65 (obr. 9b). Pozoruhodné je, že silná aktivace CD4+ specifická pro pp65 u d172 korelovala se silnou odpovědí specifickou pro pp65 v ELISpotu a silná aktivace CD8+ specifická pro pp65 (d290) a IE-1 (d361) byla spojena s vysokým počtem skvrn v odpovídajícím ELISpotu (obr. 9a-b), což naznačuje, že tyto efektorové buňky reagující na CMV významně přispívají k detekovaným signálům ELISpotu. Celkově tato data prokazují schopnost proteinů T-activated® IE-1 a pp65 stimulovat širokou škálu CMV specifických efektorových buněk. Tyto experimenty rovněž odhalily vysokou heterogenitu odpovědí mezi zdravými CMV-seropozitivními jedinci. Zejména pozorování, že někteří jedinci reagují buď na IE-1, nebo na pp65, zdůrazňuje význam hodnocení odpovědi na oba antigeny. Sledování odpovědí specifických pro IE-1 i pp65 v optimalizovaném testu IFN-γ ELISpot by mohlo zlepšit celkovou citlivost testu.

.