Typy hemocytů u cvrčků

Obrázek 1A ukazuje obraz hemocytů cvrčka v mikroskopu s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC), na kterém jsou vidět buňky různých velikostí a tvarů. Pro přesnou identifikaci těchto hemocytů bylo přibližně 1 000 buněk klasifikováno podle velikosti a morfologie (údaje nejsou uvedeny) do šesti typů (obr. 1B~G). Jak ukazuje obr. 1B, v hemolymfě byl pozorován typický granulocyt. Granulocyty měly obvykle kulatý nebo oválný tvar a v cytoplazmě bylo pozorováno mnoho polymorfních granulí. Na plazmatické membráně granulocytů byly pozorovány malé pseudopodie nebo filopodie (obr. 1B, označené bílými šipkami). Buňky zobrazené na obr. 1C byly považovány za plazmocyty vzhledem k jejich typickému vřetenovitému tvaru a dlouhým, vláskovitým strukturám pozorovaným na obou koncích plazmatické membrány (označeno bílými šipkami). Obrázek 1D ukazuje prohemocyt, což jsou nejmenší kulaté buňky pozorované v hemolymfě hmyzu. Jádra byla vzhledem k velikosti buňky velká a nacházela se uprostřed buňky (obr. 1D). Cytoplazma a jádro prohemocytů tak byly často nerozlišitelné. Na obrázku 1E je zobrazen koagulocyt obsahující různá cytoplazmatická granula. Plazmatické membrány koagulocytů byly hladké, bez jakýchkoli struktur a jejich jádra byla velká a snadno pozorovatelná. Oenocytoidy byly největším typem pozorovaných hemocytů a v hemolymfě jich bylo málo (obr. 1F). Oenocytoidy měly obvykle tvar kulatého smaženého vejce s četnými cytoplazmatickými granulemi. Obrázek 1G ukazuje sférocyty, které byly kulaté a středně velké s mnoha drobnými tmavými nebo lesklými granulemi v cytoplazmě. Jak je vidět na obr. 1D~G, na plazmatických membránách prohemocytů, koagulocytů, oenocytoidů a sférocytů, které byly opticky velmi hladké, nebyly vidět žádné struktury.

Šest typů hemocytů pozorovaných v krvi cvrčků. Celkový tvar a relativní velikost hemocytů v hemolymfě (A). Šest typů hemocytů zjištěných u G. bimaculatus bylo na základě velikosti a morfologie klasifikováno jako granulocyty (B ; GR), plazmocyty (C ; PL), prohemocyty (D ; PR), koagulocyty (E ; CO), oenocytoidy (F ; OE) a sférocyty (G ; AD). Vějířovité nebo amébovité struktury na plazmatické membráně granulocytů a plazmocytů jsou označeny bílými šipkami (B a C). Měřítko = 25 µm (A) nebo 10 µm (B~G).

Nodulace a enkapsulace hemocyty

Buněčné imunitní reakce, jako je nodulace, enkapsulace a fagocytóza, jsou u hmyzu prováděny imunitními hemocyty, jako jsou granulocyty a plazmocyty. Po vystavení patogenu tyto hemocyty mění svůj tvar a v jejich plazmatických membránách vznikají velké amébovité nebo vějířovité struktury. Abychom mohli tyto rychlé morfologické změny pozorovat v reálném čase, vyvinuli jsme techniku, která nám umožňuje kultivovat hmyzí hemocyty po dobu 7 dnů při zachování fyziologické aktivity (popsáno v Materiálech a metodách). Přestože se nám nepodařilo vytvořit stabilní linie hemocytů, které by bylo možné pasážovat po dobu několika let, mohli jsme pozorovat morfologii hemocytů v reakci na patogeny in vitro. Doplňkový film C ukazuje pouze hemocyty po 12hodinové inkubaci. Většina kultivovaných buněk se aktivně pohybovala. Některé buňky vykazovaly během kultivace síťky kolem buněčné membrány a bylo zjištěno, že jsou přichyceny ke kultivačním sklíčkům. Hemocity se zřídka shlukovaly nebo vytvářely velké shluky.

Obrázek 2A ukazuje hemocyty kultivované s E. coli (viz také doplňkový film 1). Bylo pozorováno, že některé hemocyty jsou více agregované a pohyblivé. S prodlužující se dobou inkubace se u konkrétních hemocytů vytvářely sítě (amébovité vlásky nebo extracelulární pasti) a různé hemocyty se pomocí těchto sítí shlukovaly do velkých shluků (obr. 2A-1~A-6; amébovité vlásky nebo extracelulární pasti označeny černými šipkami). Jak je znázorněno na obr. 2A-1, tři skupiny hemocytů (označené černými kroužky) byly nakonec sítěmi staženy do jednoho shluku (obr. 2A-5 a A-6).

Snímky živých buněk hemocytů cvrčků infikovaných E. coli nebo kuličkami Sephadex. (A) Snímky ze světelného mikroskopu zobrazující hemocyty kultivované s E. coli. S prodlužující se dobou inkubace se u specifických hemocytů vytvářely sítě (amébovité vlásky nebo extracelulární pasti; označené černými šipkami). Všech šest typů hemocytů bylo těmito sítěmi agregováno do velkých shluků (A-1~A-6; označeno černými rámečky). Film je k dispozici jako film 1 (čas v minutách po inokulaci). (B) Snímky ze světelného mikroskopu zobrazující hemocyty kultivované s kuličkami Sephadex. Sefadexové kuličky kolem hemocytů byly náhodně označeny SP1, SP2, SP3, SP4 a SP5. Postupem času byly kuličky Sephadex (SP1, SP2, SP3 a SP4) obklopeny hemocyty a obaleny různými typy sítí (B-1~B-9; označeny černými šipkami). Film je k dispozici jako film 2 (čas v minutách po inokulaci). Měřítko = 25 µm (A a B). Snímek C ukazuje hemocyty kultivované samostatně, bez kuliček Sephadex. Většina hemocytů se aktivně pohybovala. Několik buněk bylo připevněno ke kultivačním sklíčkům pomocí sítí z plazmatické membrány. Velké shluky hemocytů však nebyly pozorovány.

Nebylo však možné určit, zda shromažďování výše popsaných hemocytů bylo vyvoláno E. coli. Pro řešení této otázky byly hemocyty aktivovány pomocí kuliček Sephadex (průměr 120 μm), které lze snadno pozorovat pomocí DIC mikroskopu (obr. 2B, doplňkový film 2). Jak ukazuje obr. 2A, kuličky Sephadexu byly zachyceny sítěmi vytvořenými specifickými hemocyty (obr. 2B; sítě jsou označeny černými šipkami ve žlutých rámečcích). Sefadexové kuličky kolem hemocytů byly náhodně označeny SP1, SP2, SP3, SP4 a SP5. Jak je patrné z porovnání obr. 2B-2 a B-3, SP1, SP2 a SP3 byly vtaženy společně a do oblasti označené žlutým rámečkem. Kromě toho byl SP1 nakonec zcela obklopen různými hemocyty (obr. 2B-9). Kulička označená SP4 se také začlenila do shluku s SP1, SP2 a SP3 (obr. 2B-4~B-9; označeno žlutým rámečkem). Postupem času se všechny kuličky Sephadex (SP1, SP2, SP3 a SP4) obklopily mnoha hemocyty. Naproti tomu byly pozorovány jednotlivé hemocyty v kontaktu s SP5, který se však nevtáhl do oblasti označené žlutým rámečkem, přestože se nacházel v podobné poloze jako SP1. Zdálo se tedy, že k nodulaci hemocyty dochází náhodně.

Aktivace granulocytů karboxylátem modifikovanými polystyrenovými latexovými kuličkami

Dále jsme zjišťovali, které hemocyty vytvářely sítě a účastnily se jednotlivých kroků imunitní odpovědi, včetně enkapsulace a nodulace. Za tímto účelem byly místo patogenů použity karboxylátem modifikované polystyrenové latexové kuličky, které lze snadno pozorovat pomocí DIC mikroskopu, a v reálném čase byly pořízeny snímky hemocytů. Obrázek 3A ukazuje hemocyty stimulované karboxylátem modifikovanými polystyrenovými latexovými kuličkami po dobu 12 hodin (doplňkový film 3). Sítě vytvořené hemocyty (označené černými šipkami) se aktivně pohybovaly kolem latexových kuliček (označené červenými šipkami) (obr. 3A-1). V průběhu času byly kuličky pohlceny sítěmi a nakonec je bylo možné pozorovat v cytoplazmě hemocytů (obr. 3A-2~A-4). Ne každá polystyrenová latexová kulička modifikovaná karboxylátem, která narazila na síť, však byla fagocytována. Zdá se tedy, že pohyb aktivovaných hemocytů neodpovídal přesně pohybu kuliček.

Snímky živých buněk granulocytů stimulovaných polystyrenovými latexovými kuličkami modifikovanými karboxylátem. (A) Snímky ze světelného mikroskopu zobrazující hemocyty kultivované s karboxylátem modifikovanými polystyrenovými latexovými kuličkami po dobu 12 h. A-1~A-4, kultivované hemocyty po 12~18 min. Je vidět, jak se kolem latexových kuliček (označených červenými šipkami) tvoří sítě vytvořené hemocyty (černé šipky). Latexové kuličky byly pohlceny sítěmi a nakonec byly zachyceny v cytoplazmě hemocytů (A-4). Film je k dispozici jako film 3 (čas v minutách po stimulaci). Měřítko = 40 µm. (B) Zvětšené snímky. (B-1) Po 4 hodinách bylo hemocyty zachyceno mnoho karboxylátem modifikovaných polystyrenových latexových kuliček (latexové kuličky, červené šipky; a specifické hemocyty, bílé kroužky). (B-2~B-6) Kultivované granulocyty po 0, 2, 4, 12 a 48 h po stimulaci. (B-2) Klidové granulocyty, které mají kulatý nebo oválný tvar. (B-3) Za 2 h po stimulaci začaly granulocyty vykazovat morfologické změny a lze pozorovat vějířovité nebo amébovité struktury plazmatické membrány (bílé šipky). (B-4 a -5) V cytoplazmě granulocytů se za 4 a 12 h po infekci nahromadilo velké množství latexových kuliček. (B-6) Za 48 h po infekci se v cytoplazmě granulocytů nahromadilo mnoho latexových kuliček, ale sítě již nebyly pozorovány a mnoho granulocytů se zdálo být inertních. Měřítko = 15 µm (B-1) nebo 10 µm (B-2~B-6).

Detailní pozorování byla provedena pomocí konfokálního mikroskopu s vysokým zvětšením (obr. 3B). Po 4 h po infekci bylo možné pozorovat karboxylátem modifikované polystyrenové latexové kuličky uvnitř určitých hemocytů (obr. 3B-1; kuličky jsou označeny červenými šipkami a konkrétní hemocyty bílými kroužky). Dále jsme podrobněji sledovali, které konkrétní buňky latexové kuličky pohltily (obr. 3B-2~B-6). Obrázek 3B-2 ukazuje klidové granulocyty, které měly obvykle kulatý nebo oválný tvar s mnoha polymorfními tmavými granulemi v cytoplazmě. Po 2 h po stimulaci polystyrenovými latexovými kuličkami modifikovanými karboxylátem začaly granulocyty vykazovat morfologické změny, včetně vějířovitých nebo amébovitých výběžků plazmatické membrány (obr. 3B-3; označeno bílými šipkami). Po 4 h po stimulaci byly v cytoplazmě granulocytů pozorovány karboxylátem modifikované polystyrenové latexové kuličky a po 12 h po stimulaci se v cytoplazmě mnoha granulocytů nahromadilo velké množství latexových kuliček (obr. 3B-4 a B-5; kuličky jsou označeny červenými šipkami a síťky bílými šipkami). Kromě toho bylo pozorováno, že se sítě v průběhu času zvětšují a rozšiřují (obr. 3B-4 a B-5). Po 48 hodinách po stimulaci se v cytoplazmě granulocytů nahromadilo mnoho latexových kuliček, ale sítě již nebyly vidět a mnoho granulocytů se zdálo být inertních (obr. 3B-6; kuličky označeny červenými šipkami).

Jak ukazuje obr. 2, zdálo se, že granulocyty se pomocí těchto sítí připojují nejen k jiným granulocytům, ale také k různým typům hemocytů. Fagocytózu jsme nepozorovali u žádného jiného typu buněk s výjimkou malého počtu plazmocytů (údaje nejsou uvedeny). Kromě toho jsme nepozorovali žádnou imunologickou aktivitu ani morfologické změny u žádného jiného typu buněk než u granulocytů a malého počtu plazmocytů.

Granulocytární lysozomy byly aktivovány injekcí E. coli

Aby se zjistilo, zda vakuoly pozorované v granulocytech jsou fagozomy související s patogenem, byly cvrčkům injikovány částice E. coli, které se používají hlavně jako markery fagocytózy a zeleně fluoreskují, když dosáhnou acidifikovaných organel, jako jsou intracelulární lyzozomy. Současně byly celkové hemocyty obarveny barvivem LysoTracker Red, které značí lysozomy. Jak ukazuje obr. 4A-1, v cytoplazmě granulocytů byl bezprostředně po vstříknutí částic pozorován zelený fluorescenční signál (fagocytované částice E. coli). Současně byl pozorován i červený fluorescenční signál, který indikuje aktivovanou tvorbu lysozomů (obr. 4A-2). Po 4 hodinách po injekci bylo možné v mnoha granulocytech pozorovat vysoce polymorfní vakuoly (obr. 4A-4 a A-5). Jsou zobrazeny sloučené snímky zeleného fluorescenčního signálu (fagocytované částice E. coli) a červeného fluorescenčního signálu (aktivované lysozomy) (obr. 4A-6). Po 12 hodinách po injekci začal zelený fluorescenční signál slábnout, zatímco červený fluorescenční signál zůstal zachován (obr. 4A-7~A-9). Po 24 hodinách po injekci se oba fluorescenční signály ztlumily (obr. 4A-10~A-12). Červený fluorescenční signál v granulocytech byl však opět pozorován 48 h po injekci (obr. 4A-13~A-15). Obrázky 4Aa~Ao ukazují vložky v panelech A-1~A-15 (označené bílými rámečky) při větším zvětšení. U cvrčků, kterým byl injikován pouze pufr PBS, byla červená a zelená fluorescence ve všech časových bodech po injekci negativní (obr. 4B).

LysoTracker Red značí lysozomy granulocytů u cvrčků injikovaných zelenými fluorescenčními částicemi E. coli. (A) Vývoj lyzozomů granulocytů v 0 h, 4 h, 12 h, 24 h a 48 h po injekci částic E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10 a A-13) Částice E. coli, které se používají jako markery fagocytózy, fluoreskují zeleně, když dosáhnou acidifikovaných organel, jako jsou intracelulární lysozomy. (A-2, A-5, A-8, A-11 a A-14) Snímky z konfokálního fluorescenčního mikroskopu granulocytů obarvených červeným LysoTrackerem (lysozomální marker). (A-1 a A-2) Zelené a červené fluorescenční signály bylo možné pozorovat v cytoplazmě granulocytů od 1 h po injekci. (A-4 a A-5) Mnoho granulocytů vykazovalo zelenou a červenou fluorescenci ve vysoce polymorfních vakuolách granulocytů 4 h po injekci. (A-7 a -8) Po 12 h po injekci zelený fluorescenční signál zeslábl, ale červený fluorescenční signál zůstal. (A-10 a A-11) Po 24 h po injekci zelený i červený fluorescenční signál téměř vymizely. (A-13 a A-14) Po 48 hodinách po injekci zelený fluorescenční signál zcela vymizel, ale červený fluorescenční signál byl opět pozorován. Jsou zobrazeny sloučené snímky zeleného a červeného fluorescenčního signálu (A-3, A-6, A-9, A-12 a A-15). (a~o) Vložky v panelech A-1 ~A-15 (označené bílými rámečky) při větším zvětšení. (B) Červený fluorescenční signál v granulocytech cvrčků, kterým byl aplikován PBS (negativní kontrola). (C) Průtoková cytometrická analýza 1 h ~ 48 h po injekci. (C-1 a C-2) Zelený fluorescenční signál byl 2,08 % za 1 h po injekci a zvýšil se na 24,6 % za 4 h po injekci. (C-3~C-5) Zelený fluorescenční signál postupně klesal na 10,87 % ve 12 h, 3,98 % ve 24 h a 1,74 % ve 48 h. (C-1-1~C-4-1) Červený fluorescenční signál se zvýšil na 69,54 % ve 12 h po injekci a klesl na 5,78 % ve 24 h po injekci. (C-5-1) Červený fluorescenční signál se opět zvýšil na 30,25 % ve 48 h po injekci. (C-1-2~C-5-2) Červený fluorescenční signál v granulocytech cvrčků, kterým byl aplikován pouze PBS pufr. (D) Analýzy průtokovou cytometrií byly opakovány třikrát.

Pro kvantifikaci zeleně a červeně fluoreskujících signálů u cvrčků, kterým byl aplikován PBS nebo E. coli, byly hemocyty analyzovány průtokovou cytometrií v 0~48 h po injekci (obr. 4C). V 0 h po injekci bylo 2,08 % hemocytů pozitivních na zelenou fluorescenci a tento podíl se zvýšil na 24,36 % ve 4 h po injekci (obr. 4C-1 a C-2). Zelený fluorescenční signál postupně klesal na 10,87 % hemocytů po 12 h, 3,98 % po 24 h a 1,74 % po 48 h (obr. 4C-3~C-5). Tyto výsledky naznačují, že částice E. coli byly aktivně pohlcovány a tráveny granulocyty a do 48 h po injekci byly zcela odstraněny. Po 12 h po injekci bylo 69,54 % hemocytů pozitivních na červenou fluorescenci a po 24 h po injekci se signál snížil na 5,78 % hemocytů (obr. 4C-1-1~C-4-1). V souladu s našimi mikroskopickými pozorováními se červený fluorescenční signál zvýšil na 30,25 % hemocytů po 48 h po injekci. Naopak u cvrčků, kterým byl aplikován PBS, byla zelená a červená fluorescence ve všech časových bodech negativní (obr. 4C-1-2~C-5-2). Analýza průtokovou cytometrií byla opakována třikrát (obr. 4D).

Reaktivace lysozomů granulocytů po 48 hodinách po infekci

Reaktivace lysozomů granulocytů po 48 hodinách po infekci byla dále zkoumána mikroskopickým pozorováním (obr. 5A a B). Jak je znázorněno na obr. 4A, zelený fluorescenční signál (fagocytované částice E. coli) a červený fluorescenční signál (aktivované lysozomy) byly pozorovány 4 h po injekci (obr. 5A-1~A-3). Fluorescenční signály se ztlumily po 24 hodinách od infikování (obr. 5A-4~A-6). Po 24 h po infekci bylo možné pozorovat buňky v cytoplazmě granulocytů (obr. 5A-4~A-6; označeny bílými šipkami). Tento jev byl více patrný 48 h po infekci (obr. 5A-7~A-9; označeno bílými šipkami). Kromě toho byly lyzozomy kolem těchto pohlcených buněk 48 h po infekci aktivovány (obr. 5A-8). Jak je uvedeno na obr. 4A-14, 4C-5-1, tato mikroskopická pozorování zřejmě vysvětlují nárůst červeného fluorescenčního signálu 48 h po infekci. Pro potvrzení této skutečnosti byla jádra granulocytů 48 h po infekci obarvena 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI). Jak ukazuje obr. 5B-1, byly často pozorovány granulocyty se dvěma jádry. Příležitostně byly pozorovány také granulocyty obsahující více než dvě jádra nebo deformovaná jádra (obr. 5B-2 a B-3; označeny bílými šipkami).

Reaktivace lysozomů granulocytů 48 h po injekci. (A) Snímky granulocytů z fluorescenčního mikroskopu po 4 h, 24 h a 48 h po injekci. (A-1 a A-2) Granulocyty vykazovaly zelené a červené fluorescenční signály ve vysoce polymorfních vakuolách 4 h po injekci. (A-4 a A-5) Po 12 h po injekci zelený fluorescenční signál zeslábl, ale červený fluorescenční signál zůstal zachován. Kromě toho byly v cytoplazmě granulocytů pozorovány některé buňky (bílé šipky). (A-7 a A-8) Tento jev byl častěji pozorován 48 h po injekci. Kromě toho byly lyzozomy obklopující tyto pohlcené buňky aktivovány (A-8). Jsou zobrazeny sloučené snímky zeleného a červeného fluorescenčního signálu (A-3, A-6 a A-9). (B) Granulocyty obarvené DAPI 48 h po injekci. (B-1) V cytoplazmě granulocytů byla pozorována dvě jádra. (B-2 a B-3) Příležitostně byla v cytoplazmě granulocytů pozorována dvě nebo více jader nebo deformovaná jádra (označeno bílými šipkami). Měřítko = 10 µm (A) nebo 20 µm (B).

Buněčná smrt granulocytů související s nekrózou 48 h po infekci

Jak je vidět na obr. 3B-6 a 5A-8, nahromadění fagozomů v granulocytech změnilo jejich tvar a vyvolalo buněčnou smrt. Po 48 h po infekci byly hemocyty obarveny annexinem V konjugovaným s fluorescein-izothiokyanátem (FITC) a propidiumjodidem (PI), aby se potvrdila apoptotická nebo nekrotická buněčná smrt (obr. 6A). Zelený fluorescenční signál (annexin V) se mezi 12. a 48. hodinou pouze mírně zvýšil (obr. A-10, A-7 a A-10), ale červený fluorescenční signál (PI) vykazoval silné barvení ve 12. hodině po infekci (obr. 6A-5). Po 24 a 48 h po infekci červený fluorescenční signál přetrvával (obr. 6A-8 a A-11). Jsou zobrazeny sloučené snímky červeného fluorescenčního signálu (PI) a snímky DIC (obr. 6A-3, A-6, A-9 a A-12). Na obr. 6Aa~Ad jsou vložky v panelech A-3, A-6, A-9 a A-12 označené rámečky při větším zvětšení. Tyto výsledky naznačují, že akumulace fagozomů v granulocytech nevyvolala typickou apoptotickou buněčnou smrt, ale buněčnou smrt související s nekrózou. Pro kvantifikaci barvení PI byly hemocyty obarveny a vyšetřeny průtokovou cytometrií v 0 h, 12 h, 24 h a 48 h po infekci. Po 12 h po infekci bylo 71,29 % granulocytů obarveno PI ve srovnání s 13,52 % po 0 h (obr. 6B-1 a B-2). Po 24 h po infekci se zbarvení PI mírně snížilo na 45,97 %, ale po 48 h se opět zvýšilo na 76,24 % (obr. 6B-3 a B-4). Analýza průtokovou cytometrií byla opakována třikrát (obr. 6C).

.