… (Zhang et al., 2009), causó graves problemas para la caracterización de las proteínas Flv4 y Flv2. Primero se especuló con que dicha asociación de membrana se produce a través de la proteína Sll0218, que es una proteína de membrana integral con cuatro hélices transmembrana predichas. Sin embargo, resultó no ser así, ya que Flv4 permaneció en gran medida en la fracción de membrana incluso en ausencia de la proteína Sll0218 (los mutantes D fl v2 , D sll0218-19 y D sll0218- 19/ fl ag – fl v4) (datos no mostrados). Además, la proteína Sll0218 se asocia a un gran complejo de membrana independientemente del heterodímero Flv2/Flv4 ( Figura 4). Finalmente, modificando el método de partición en dos fases para el subfraccionamiento de membranas, la proteína Sll0218 se localizó en la membrana tilacoide, mientras que Flv4 y Flv2 en ese sistema tienden a asociarse con la membrana plasmática (Figura 2D). Esta última asociación parecía ser fuertemente dependiente de los cationes (Figuras 2B y 2C). Recientemente se informó de un comportamiento similar para otra proteína de Synechocystis, aunque el mecanismo de la asociación con la membrana no está claro (Carmel et al., 2011). Basándose en el modelo del heterodímero Flv2/Flv4 y en la alineación de la secuencia, se reconocieron en la superficie de la proteína algunos sitios putativos de unión a metales que implican residuos de His, Asp y Glu. También se encontraron metales unidos a la superficie en estructuras homólogas. Por ejemplo, el dominio fl avodoxin-like de Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) tiene un Ca 2+ , y M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG, y 1YCH) tiene varios Zn 2+ unidos en la superficie (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Los iones metálicos en las estructuras proceden de la solución de cristalización, pero algunos de los residuos de unión a metales se conservan o se sustituyen por residuos similares en nuestro modelo (véase la Tabla Suplementaria 2 en línea). En conjunto, estos residuos podrían ser responsables de la asociación dependiente de cationes de Flv2 y Flv4 a la fracción de membrana. Basándonos en el análisis del potencial electrostático de la superficie del modelo, el monómero Flv4 tiene una superficie más cargada negativamente (Figura 8B) y contiene más sitios putativos de unión a metales en la superficie que el monómero Flv2 (véase la Tabla Suplementaria 2 en línea). Teniendo en cuenta que la concentración de cationes utilizada en el tampón de aislamiento es mucho mayor que las condiciones fisiológicas reales (Figuras 2B a 2D), la unión de Flv2/Flv4 a la membrana in vivo podría ser transitoria y reversible. La especificidad de Flv2/Flv4 a la membrana plasmática tras la rotura de la célula (Figura 2D) también puede estar relacionada con su carga superficial, ya que la superficie interna de la membrana plasmática es más negativa que la membrana tilacoide del lado derecho (Barber, 1982; Körner et al., 1985). Sin embargo, la carga superficial de la membrana del tilacoide puede cambiar drásticamente durante la fotosíntesis, lo que puede mediar la unión en tránsito de Flv2/Flv4 también con la membrana del tilacoide. La proteína Sll0218 se localizó inequívocamente en un complejo de alta masa molecular en la membrana del tilacoide. Sin embargo, el extraño comportamiento de la proteína Sll0218 en el sistema convencional de partición en dos fases de las subfracciones de la membrana sugirió que la proteína Sll0218 no está distribuida uniformemente en la membrana del tilacoide. Está asociada a un gran complejo, que es sólo marginalmente más pequeño que el dímero principal del PSII. El aumento de la relación entre los complejos dímero y monómero del PSII sólo se produce en los mutantes que carecen de la proteína Sll0218 ( D sll0218-19 y D fl v4 ), pero no en D fl v2 (Figura 5, Tabla 1). Por lo tanto, postulamos que la Sll0218 puede funcionar como chaperón en la estabilización del dímero del PSII ensamblado en condiciones de nivel atmosférico de CO 2 . Aunque el complejo PSII ha sido aislado tanto en forma monomérica como dimérica (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), es ampliamente aceptado que in vivo el complejo PSII funciona como un dímero en cianobacterias así como en plantas superiores (Hankamer et al., 1999; Kuhl et al., 2000), mientras que el PSII monomérico puede ser un intermedio del ensamblaje y reparación normal del PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Aunque la dimerización in vivo del PSII en las cianobacterias ha sido cuestionada debido al uso de detergentes para la solubilización y el análisis in vitro de los complejos del tilacoide (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), existen pruebas convincentes de la formación de dímeros mediante enfoques mutantes. De hecho, las pequeñas subunidades del PSII, PsbM y PsbT, localizadas en la interfaz monómero-monómero, han demostrado ser cruciales para el correcto ensamblaje y reparación del PSII (Ohnishi y Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Dado que la proteína Sll0218 sólo se expresa en condiciones de CO 2 bajo (es decir, a nivel del aire), postulamos que el ensamblaje de los dímeros del PSII difiere dependiendo de la presencia o ausencia de las proteínas Sll0218 (véase más adelante). La optimización de la fotosíntesis requiere una regulación estricta entre la absorción y la conversión de la energía solar en energía química y su utilización por las vías metabólicas posteriores. Para los fotoautótrofos acuáticos, como las cianobacterias, el CO 2 es un sustrato esencial pero a menudo deficiente. En entornos naturales, la insuficiente disponibilidad de CO 2 , especialmente cuando se combina con una alta irradiación, provoca una alta presión de excitación en los fotosistemas (Huner, 1998) y limita la tasa de fotosíntesis. Para hacer frente a esto, varios mecanismos de concentración de CO 2 son fuertemente inducidos en condiciones de baja Ci en las cianobacterias para aumentar la concentración de CO 2 alrededor de la ribulosa-1,5-bis-fosfato carboxilasa/oxigenasa y al mismo tiempo inducir el flujo cíclico de electrones para generar más ATP (revisado en Kaplan y Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Los estudios de microarrays y proteómicos han revelado un estimulón de bajo CO 2 (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), que también incluye el operón sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ), que está regulado tan fuertemente como los genes del mecanismo de concentración de CO 2 inducible. Los genes fl v2 y fl v4 también tienen una alta respuesta a la luz (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). Los mutantes de inactivación de fl v4 y fl v2 revelaron una alta susceptibilidad a la fotoinhibición del PSII en condiciones de nivel de CO 2 en el aire (Zhang et al., 2009). Además, nuestros recientes estudios sobre la expresión del operón revelaron una estrecha regulación de este operón fl v4- fl v2 por pequeños ARN reguladores (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess y E.-M. Aro, datos no publicados). Esta fuerte inducción y regulación por ARNs antisentido del operón fl v4- fl v2 junto con la protección observada del PSII bajo el nivel de CO en el aire y el alto …