Aquí presentamos un método para la determinación del pKa de la histidina en sistemas complejos o heterogéneos que no son susceptibles de espectroscopia de RMN en estado sólido ni en solución. La síntesis cuidadosa de una histidina fluorenilmetilocarbonilada y protegida con tritil, deuterada, produce un aminoácido equipado con una sonda vibracional que puede incorporarse fácilmente a cualquier péptido accesible por métodos estándar en fase sólida. La frecuencia de la única vibración de estiramiento activa por Raman de esta sonda C2-D es un claro indicador del estado de protonación de la histidina. Aquí investigamos un péptido sensible al pH que se autoensambla para formar un hidrogel a pH neutro. El pKa del residuo solitario de histidina en el péptido, que es probablemente el responsable de este comportamiento dependiente del pH, no puede investigarse mediante espectroscopia de RMN debido a la naturaleza supramolecular y blanda del gel. Sin embargo, después de sintetizar un péptido que contiene C2-deuterado-histidina, pudimos seguir el estado de protonación de la histidina a lo largo de una valoración de pH utilizando la espectroscopia de diferencia Raman, determinando así con precisión el pKa de interés.