Procedimientos de inmunoblot

Esta técnica analítica procede en los siguientes pasos. Las proteínas se separan generalmente por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS). A continuación, se transfieren a una membrana sintética mediante métodos de secado, semiseco o húmedo. En el campo eléctrico generado por una fuente de alimentación, las proteínas recubiertas con SDS cargado negativamente migran hacia el electrodo positivo. A medida que las proteínas migran fuera del gel, son capturadas en una membrana. La unión de las proteínas a la membrana es un mecanismo irreversible. Las membranas pueden ser de nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno (PVDF) o nylon. La membrana puede bloquearse con albúmina de suero o solución láctea para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. A continuación, se realiza un sondeo con anticuerpos específicos de la proteína que se estudia en la membrana, un método similar a la inmunohistoquímica, pero sin necesidad de fijación. Esta técnica aprovecha la especificidad inherente al reconocimiento antígeno-anticuerpo. La detección se realiza normalmente utilizando anticuerpos secundarios ligados a cromógenos o peróxidos para catalizar una reacción cromogénica o quimioluminiscente.