Fylogeni hos Holometabola

Vi analyserade sammanlagt 1343 ortologiska gener i förhållandet 1:1 (dvs., grupper av ortologiska sekvenser, även kallade ortologgrupper (OGs)) och, genom att inkludera även publicerade data, data från totalt 88 arter (tabell 1). De sju särskilt utformade avgörande dataset som vi analyserade för att besvara våra sju fylogenetiska frågor bestod var och en av dem av en delmängd taxa och gener från det fullständiga datasetet, med undantag för dataset 1 som är identiskt med det fullständiga datasetet. De sju frågorna, de taxonomiska grupper som vi valde ut som relevanta för att besvara frågorna samt antalet arter och OGs för varje dataset visas i tabell 2. För varje dataset utförde vi 1) ML trädrekonstruktion och 2) Four-cluster Likelihood Mapping (FcLM) (se tabell 3). Resultaten sammanfattas i figur 1 (se Additional file 1: Figures S1-S7 för förekomst och frånvaro av gener i datamängderna, Additional file 2: Figurerna S8-S15 för de fullständiga fylogenetiska träden och Additional file 3: Figures S17-S25 för de fullständiga resultaten av FcLM).

Analysen av dataset 1 gav Hymenoptera som systergrupp till alla återstående holometaboliska ordningar i både ML-trädsrekonstruktion och FcLM (tabell 3, figur 1). Detta förhållande hade redan återfunnits i flera studier med flera gener (t.ex. ), och baserat på helgenomdata men ett begränsat taxonprovtagning . Tidigare publicerade analyser av morfologiska data gav motsägelsefulla resultat, som till exempel Hymenoptera + Mecopterida i Beutel och Gorb jämfört med Hymenoptera + resterande holometaboliska ordningar i Beutel et al. . Potentiella problem med topologiska artefakter i dessa analyser som orsakas av konvergerande minskningar i många morfologiska karaktärssystem diskuterades i detalj av Friedrich och Beutel och Beutel et al. . Placeringen av Hymenoptera som systergrupp till alla återstående holometaboliska ordningar innebär att förmodade synapomorfer hos Hymenoptera och Mecopterida (t.ex. enkel klo hos larver, sklerotiserad sitophoreplatta hos vuxna; se ) i själva verket är homoplasier.

Våra analyser av dataset 2 gav monofyletiska Neuropteroidea (dvs, en klad som omfattar Neuropterida, Coleoptera och Strepsiptera) med maximalt stöd i ML-trädrekonstruktionen och starkt stöd i FcLM (tabell 3, figur 1). Neuropteroidea stöddes inte som en klad i Beutel et al. , men befanns vara monofyletisk i många tidigare studier , även om det i de flesta fall var med svagt eller inget stöd.

Vi hittade ingen signal för parafyletiska Megaloptera som diskuterades av Beutel et al. och Winterton et al. (dataset 3, tabell 3, figur 1). Inom Neuropterida stödde våra ML-analyser maximalt ett systergruppsförhållande mellan Raphidioptera och Neuroptera + Megaloptera, vilket också stöddes av mer än 2/3 av alla kvartetter i FcLM (dataset 4, tabell 3, figur 1). De fylogenetiska relationerna mellan neuropteridordningarna har diskuterats kontroversiellt med två alternativa hypoteser: Raphidioptera + Megaloptera är monofyletiska (t.ex. ) eller Neuroptera + Megaloptera är monofyletiska (t.ex. ). Våra resultat stöder starkt den senare hypotesen.

Analysen av dataset 5 gav tvetydiga resultat med avseende på en möjlig klad som omfattar Coleoptera och Strepsiptera (Coleopterida) (tabell 3, figur 1). Det är svårt att lösa detta långvariga problem på grund av den extremt modifierade morfologin (t.ex. ) och de tydligt härledda genomiska egenskaperna hos de endoparasitiska Strepsiptera (”the Strepsiptera problem”, ; ”insects from outer space”, ). I de senaste bidragen har man funnit bevis för monofyletiska Coleopterida (t.ex. ). De studier som bygger på molekylära data förblev dock tvetydiga i sina resultat. Coleopterida stöddes inte av alla dataset som analyserades av McKenna och Farrell . Resultaten från Wiegmann et al. baserades på en relativt liten uppsättning gener och visade endast svagt stöd för denna klad. Niehuis et al. analyserade nukleotidsekvenser av hela arvsmassan hos holometabola insekter och fann ett bra stöd för Coleopterida, men taxonprovtagningen omfattade inte några neuropteridordnar. I vår studie får Coleopterida stöd i ML-trädet (med maximalt bootstrapstöd), men inte i FcLM-analyserna (tabell 3, figur 1). I ML-trädet placeras Strepsiptera inom Coleoptera (liksom i några av McKenna och Farrells träd ), dock med dåligt stöd för relationerna (Additional file 2: Figur S12). Vi analyserade vidare om inkongruensen mellan ML-trädsrekonstruktionen och FcLM-analyserna försvann om man beaktar partitionerade ML- och FcLM-analyser med olika modeller på olika partitioner. Partitionerade analyser kan minska potentiella modellfelspecifikationer och kan ge kongruenta topologier. Men motsättningen mellan ML- och FcLM-analyser försvann inte (tabell 3, Additional files 2 och 3). Detta innebär att modellfelspecifikationer på grund av icke-partitionerade analyser inte är källan till inkongruensen (se även och diskussionen där). Uppenbarligen gav data och analysförfaranden i vår studie inte en entydig lösning på frågan om Coleopterida är en monofyletisk grupp eller inte. Bevis från morfologin tyder dock tydligt på monofyletiska Coleopterida (se även ) som det mest troliga resultatet.

För att testa om Mecopterida, en klad som omfattar Amphiesmenoptera (Lepidoptera + Trichoptera) och Antliophora (Diptera + Siphonaptera + Mecoptera), är monofytisk, analyserade vi två versioner av dataset 6 för att ta hänsyn till två möjliga hypoteser (dataset 6a, b; tabellerna 2 och 3). I båda analyserna återfanns monofyletiska Mecopterida med starkt stöd (tabell 3, figur 1). Monofyletiska Mecopterida, som föreslogs av Hinton under namnet Panorpoidea (eller panorpoidkomplexet), fick inget bra stöd i Kjer et al. och Wiegmann et al. och fick endast stöd i de bayesianska analyserna av morfologiska karaktärer i Beutel et al. Niehuis et al. hittade ett tentativt stöd för denna klad som bygger på helgenomdata, men den ofullständiga taxonprovtagningen – genomerna hos Neuropterida, Trichoptera, Siphonaptera och Mecoptera har ännu inte sekvenserats – minskade den här datamängdens beslutsamhet när det gäller frågan om monofyletiska Mecopterida.

Våra analyser bekräftade tydligt att Amphiesmenoptera (Trichoptera + Lepidoptera) är monofysiska (figur 1). Vi testade dock inte denna hypotes med ett särskilt utformat dataset eftersom den aldrig har ifrågasatts på allvar.

Inom Antliophora, som uppvisade maximalt bootstrap-stöd i ML-trädet, fann vi ett systergruppsförhållande mellan Mecoptera och Siphonaptera, också med maximalt bootstrap-stöd och med maximalt stöd i FcLM (dataset 7, tabell 2, figur 1). Detta resultat bekräftar åsikter som framförts av Beutel och Gorb , McKenna och Farrell och Wiegmann et al. även om kladen Mecoptera + Siphonaptera inte fick något bra stöd i den sistnämnda studien. Ett systergruppsförhållande mellan Diptera och Siphonaptera som återfanns i Beutel et al. (, se diskussion där) är högst osannolikt baserat på våra analyser.

Med den här studien bidrar vi inte till frågan om Mecoptera är en monofyletisk grupp eftersom endast en art, Nannochorista philpotti, ingick i vår taxonprovtagning. Morfologiska data och analyser av nio nukleära gener tyder dock starkt på att Mecoptera verkligen utgör en monofyletisk grupp.

Sammanfattningsvis har vi härlett en solid fylogenetisk ryggrad av Holometabola, med tre maximalt understödda megadiversifierade klasser Hymenoptera, Neuropteroidea och Mecopterida, med cirka 135 000, 370 000 respektive 300 000 beskrivna arter. För den väldefinierade enhet som omfattar Neuropteroidea och Mecopterida föreslår vi namnet Aparaglossata (figur 1). Namnet hänvisar till förlusten av paraglossae, en av gruppens mest iögonfallande apomorfier (se nedan och tabell 4).

Vår sammanställning av molekylära sekvensdatamängder och vår utformning av den fylogenetiska analysen uppvisar några stora skillnader jämfört med tidigare studier av Holometabolas fylogeni. Specifikt i) Vi använde en massiv mängd data som genererades med Illumina Next Generation Sequencing (tabell 1). ii) Vi säkerställde beslutsamheten i våra dataset genom att specifikt utforma dataset för var och en av våra sju forskningsfrågor (tabell 2) (se ). Beslutsamhet innebär att alla gener som ingår i ett dataset omfattas av minst en representant för alla taxonomiska grupper som är relevanta för det specifika fylogenetiska samband som studeras. Följaktligen har varje dataset en täckning på 100 % när det gäller förekomst av gener, med avseende på de relevanta taxonomiska grupperna. Genom att säkerställa beslutsamhet lindrar vi de potentiellt vilseledande effekterna av saknade uppgifter. Saknade uppgifter kan leda till att man drar slutsatser av topologier med högt stöd men felaktiga topologier (se ). iii) Vi utförde FcLM för vart och ett av våra sju dataset (tabell 3). Vi återimplementerade FcLM i RAxML för att klara av dessa storskaliga datamatriser och kompletterade metoden med nyskrivna skript som mappar respektive resultat till 2D-simplexgrafer. Bootstrap-stödet i enbart fylogenetiska träd är av begränsad styrka vid analyser av mycket stora datamängder . FcLM är en metod för att identifiera möjligt stöd för alternativa topologier i en datamängd, dvs. en metod för att visa inkongruenta signaler som kanske inte kan observeras i fylogenetiska träd. Denna studie är den första som tillämpar FcLM på stora fylogenomiska supermatriser. Slutligen iv) kontrollerade vi alla dataset för oseriösa taxa. Rogue taxa är taxa som intar flera fylogenetiska positioner i en uppsättning bootstrapträd. De minskar upplösningen och/eller stödet, till exempel när man bygger bootstrapkonsensusträd. Om man tar bort oseriösa taxa kan man få fram ett mer informativt bootstrapkonsensusträd (se tilläggsfil 4, kapitel 4). Alla våra dataset var fria från rogues.

Med en sammanställning av dataset som presenteras här (dvs. genom att extrahera det maximala antalet gener som kan bidra till att lösa det fylogenetiska förhållandet i fråga) säkerställde vi också att härledda topologier inte baserades på ett godtyckligt urval av gener med avseende på deras inneboende fylogenetiska signal. Dell’Ampio et al. visade att urvalet av gener – om det inte styrs av överväganden om hur avgörande ett dataset är – kan generera topologiskt olika träd som ändå alla kan uppvisa högt stöd. Vidare visade Simon et al. att gener som är involverade i olika biologiska vägar kan stödja olika topologier för ett specifikt fylogenetiskt förhållande. Man kan därför dra slutsatsen att fylogenetiska träd som härleds från studier av endast en uppsättning av några få till flera gener lätt kan vara snedvridna och därför kanske inte återspeglar det korrekta artträdet. Även om det för närvarande bästa tillvägagångssättet för att ta itu med detta problem är att inkludera största möjliga mängd potentiellt informativa data, måste vi ytterligare reda ut de bidragande faktorerna till topologiska inkongruenser i datamängder (se även ).

Fylogenetiska studier uteslutande baserade på morfologi (t.ex. ) har också gett problematiska grupperingar i vissa fall. Författarna tog upp och diskuterade uppenbara artefakter som främst orsakades av parallella minskningar av karaktärskomplex (t.ex. flygapparaten). Problemen visade sig dock vara olösliga med tanke på de data och analytiska förfaranden som fanns till hands . Med våra molekylära dataset kunde vi tillhandahålla tillförlitliga lösningar för de flesta interordinella fylogenetiska relationer inom Holometabola (figur 1 och ovan). För att spåra evolutionära förändringar på fenotypisk nivå använde vi det mest omfattande morfologiska datasetet som för närvarande finns tillgängligt, inklusive 356 karaktärer hos representanter för alla holometabola-ordnar och hos noggrant utvalda taxa som tillhör en outgroup . Karaktärerna kartlades på den transkriptombaserade fylogenin i en formell metod (se avsnittet Metoder för detaljer). Detta gjorde det möjligt för oss att spåra och omtolka evolutionära förändringar av många karaktärer och att genomföra parsimony-baserade grundplansrekonstruktioner för alla klasser i trädet (se ”Utvecklingen inom holometabola” nedan).

Evolutionen inom Holometabola

Larver och utveckling

Våra fylogenetiska resultat tyder på att Holometabolas förfäders larv var terrestrisk, ortognatisk, utrustad med måttligt förenklade men tydligt utvecklade sammansatta ögon och välutvecklade bröstben. Abdominalben och cerci saknades (figur 2). Muskelsystemet var generellt sett välutvecklat. Tydliga förenklingar av antennerna och de labiala enditloberna och tillhörande muskler är larvala autapomorfier hos Holometabola. Det ortognatiska huvudet i grundplanet tyder på att de tidigaste holometabola-larverna livnärde sig externt på växtmaterial eller svampar och inte grävde i substratet eller trängde in i trånga sprickor (t.ex. under bark).

Förfaderns aparaglossatanlarv var troligen prognathisk och utrustad med stemmata. Huruvida dessa larver var av den smidiga campodeidtypen, som larverna hos många skalbaggar (t.ex. Adephaga, Myxophaga , Staphylinoidea), Strepsiptera (första instar), Neuropterida och vissa grupper av Trichoptera (t.ex. Rhyacophilidae), är fortfarande oklart. Det är tänkbart att denna larvtyp är ett apomorft tillstånd som kännetecknar Neuropteroidea, med parallell utveckling hos Trichoptera. Prognathism är ofta kopplad till köttätande matvanor (Neuropterida, Adephaga och vissa polyfaga undergrupper), men kan också vara kopplad till att tränga in i trånga sprickor eller gräva i substrat, vilket är fallet hos de vedlevande larverna hos Archostemata (Coleoptera), men också hos tidiga lepidoptera-släktingar (t.ex. ). Det är alltså oklart om de förfäderna av aparaglossatans larver var rovdjur eller inte. Larver av Mecopterida uppvisar vissa förenklingar (tentorium och antennsegment), och en tydlig tendens till reducering kännetecknar larver av antliophoraner, särskilt de av Siphonaptera och Diptera. Båda har helt förlorat sina bröstben (tydligt förkortade hos Mecoptera) och kännetecknas av förenklingar av de cefala strukturerna, särskilt av muskelsystemet . Detta återspeglar den utbredda larviga livshistorien hos Antliophora, där larverna lever i det övre jordlagret, bladavfall, fuktiga substrat eller olika vattendrag och huvudsakligen livnär sig på mjuka substrat eller små partiklar. Den viktiga frågan om de förhistoriska Antliophora-larverna var terrestriska (Lepidoptera, Mecoptera, Siphonaptera, Mecoptera exkl. Nannochoristidae, Diptera partim) eller akvatiska (Trichoptera, Nannochoristidae, Diptera partim) förblir tvetydig.

Våra fylogenetiska resultat visar tydligt att en typisk holometabolisk utveckling med larver som helt saknar yttre vingknoppar (”endopterygota insekter”) och även saknar cerci tillhör grundplanen för Holometabola (se även ). De förhållanden som kännetecknar strepsipteriska primärlarver (abdominalsegment XI och cerci närvarande) och sekundärlarver (yttre vingknoppar som kan kännas igen som yttre konvexiteter) är uppenbarligen resultatet av omkastningar, som det tidiga uppträdandet av de blivande sammansatta ögonen (se ). I stort sett immobiliserade puppor med immobiliserade mandibler (pupa adectica) har med största sannolikhet utvecklats flera gånger oberoende av varandra. Det förefaller troligt att en rörlig puppa med rörliga mandibler som den är karakteristisk för Raphidioptera är förfäder för Holometabola även om detta inte bekräftas av en formell karaktärsanalys.

Vuxna och äggnedläggning

Förfaderns holometabola vuxen skiljde sig tydligen bara lite från neopteranernas grundplan (Neoptera: alla bevingade insekter utom Odonata och Ephemeroptera). De cefala strukturerna, hela muskelsystemet, flygapparaten och bukstrukturerna verkar i stort sett oförändrade . De mest djupgående apomorferna hos vuxna holometabola insekter är relaterade till invaginationen av de pterothorakala sterniterna (t.ex. tätt intilliggande meso- och metacoxae) . Våra uppgifter leder inte till en tillförlitlig bedömning av de vuxna holometabola insekternas ursprungliga matvanor, men det är uppenbart att matning i vuxenstadiet spelade en mindre roll jämfört med matning i larvstadiet. Undantag från denna regel är till exempel rovlevande skalbaggar (t.ex, Dytiscidae och Carabidae) med en mycket snabb postembryonal utveckling och långlivade vuxna.

Distinkta morfologiska karaktärsförändringar kännetecknar uppkomsten av Aparaglossata: minskningen av de labiala ändloberna (paraglossae), inklusive musklerna, den distinkta modifieringen av den ortopteroida ovipositorn, och möjligen det reducerade antalet malpighianska tubuli (även hos Acercaria (äkta insekter, psocopteraner, löss och släktingar)) . Våra resultat gör det inte möjligt att göra en entydig rekonstruktion av flygapparatens ursprungliga tillstånd för Holometabola och Aparaglossata. Det verkar rimligt att ungefär lika stora pterothorakala segment (som hos Neuropterida, tidiga lepidoptera-linjer och Mecoptera) är plesiomorfa för Aparaglossata, men rekonstruktionen av det förfäderliga tillståndet för denna karaktär i den formella analysen förblev tvetydig. Som påpekats ovan är frågan om Coleopterida är en monofylisk grupp eller inte inte helt avgjord. Det förefaller dock rimligt att anta att posteromotorismen utvecklades endast en gång hos en gemensam förfader till Strepsiptera och Coleoptera, med en rad relaterade kännetecken, t.ex. storleksminskning av mesothorax, en tydlig minskning av mesothoraxmuskulaturen och en ökad storlek på metathorax. En tydlig anteromotorik som den finns hos Hymenoptera, Trichoptera, ”högre” Lepidoptera och Diptera är möjligen ursprunglig hos Holometabola, men det är tänkbart att detta tillstånd har utvecklats (sekundärt?, se ovan) flera gånger oberoende av varandra (t.ex,

Vingarnas kopplingsmekanismer har tydligen utvecklats oberoende av varandra hos Hymenoptera (hamuli som en autapomorfi i ordningen, se Additional file 4, kapitel 5), Trichoptera, Lepidoptera och vissa familjer av Neuroptera (olika mekanismer förekommer i dessa ordningar).

Det primära sättet att lägga ägg hos Holometabola var med stor sannolikhet endofytiskt, vilket kan antas för grundplanet av Hymenoptera (”Symphyta”). Detta sätt att lägga ägg kan man hävda att det bibehålls i Neuropteroideas grundplan. Raphidioptera har en modifierad, långsträckt ovipositor som de använder för att lägga ägg under bark eller i markstrumma. Detta liknar den äggdeponering som antagits för Holometabola och Hymenoptera, men det kan också vara en härledd karaktär. Den fullständiga eller nästan fullständiga reduktionen av element i den primära äggläggaren är ett kännetecken för Mecopterida och har uppenbarligen samband med ytlig äggnedläggning eller äggläggning i mjuka substrat. Våra resultat bekräftar till största delen ett evolutionärt scenario för honans postabdomen och äggnedläggning som beskrivs i detalj i Hünefeld et al. .