Upptäckt av Ganoderma lucidum triterpenoider som potentiella hämmare mot Denguevirus NS2B-NS3 proteas

NS2B-NS3 proteas
Virtuell screening och analys av dockningssimuleringar
Molekylär interaktion och MM/GBSA-analys
Molekylär dynamik (MD)-analys

NS2B-NS3 proteas

Dreidimensionell struktur (3D) av målproteinet har etablerats som ett primärt krav för att hitta läkemedel. Både röntgenkristallografiska strukturer och homologimodeller som genererats för målproteiner har använts för att identifiera potentiella ligander från kemiska databaser, men 3D-kristallografiska strukturer har dokumenterats vara mer effektiva än in silico genererade homologimodeller. Därför hämtades 3D-strukturen av DENV NS2B-NS3-proteas, som har föreslagits som ett viktigt terapeutiskt mål mot DENV-infektion, från protein data bank (PDB) med PDB ID:2FOM40. Kristallstrukturen av NS2B-NS3pro löstes upp med en upplösning på 1,5 Å och uppvisade två proteinkedjor, dvs. kedja A som är veckad för att bilda NS2B-kofaktorn och kedja B som består av NS3pro-domänen (fig. 2a). Här valdes proteasdomänen (NS3pro) i kedja B (fig. 2b) ut för strukturbaserad virtuell screening med utvalda triterpenoider från G. lucidum.

Virtuell screening och analys av dockningssimuleringar

På senare tid har strukturbaserad virtuell screening vunnit popularitet för upptäckt av nya ledande föreningar från stora bioaktiva kemiska bibliotek mot utvalda mål. Detta tillvägagångssätt omfattar simulerad dockning av ligander vid den valda receptorns aktiva plats, följt av rangordning och poängsättning av hämmare23. I detta arbete genomförde vi en strukturbaserad virtuell screening av 22 kända antivirala triterpenoider från G. lucidum mot NS3pro med hjälp av Glide-modulen i Schrodinger-sviten (tabell S1). Dessa hämmare analyserades vidare med hjälp av Glide-modulens XP-dockningsprotokoll för att samla in information om bindningsenergi samt ytterligare bindningsmönster med resterna på den aktiva platsen. Det observerades att alla utvalda triterpenoider uppvisade betydande bindningsaffiniteter mot NS2B-NS3pro med undantag för ganoderinsyra G (tabell S1). Molekylär dockning av referenshämmaren 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrakinon mot samma aktiva plats gav också en dockningspoäng på -5,377 kcal/mol. Därför valdes triterpenoider med bättre dockingresultat än ett tröskelvärde på -5 kcal/mol ut för analys av den molekylära interaktionen. Vi valde totalt fyra triterpenoider, dvs. ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), lucidumol A (-5,993 kcal/mol), ganoderinsyra C2 (-5,948 kcal/mol) och ganosporersyra A (-5,830 kcal/mol) som möjliga hämmare för NS3pro-domänen hos DENV-proteas. Dessa dockningspoäng ansågs vara betydande i jämförelse med den kända hämmaren 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrakinon (-5,377 kcal/mol) och rapporterade bioaktiva molekyler Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) och Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) från Azadirachta indica med DENV NS3pro41. Dessa resultat visar på potentialen hos bioaktiva triterpenoider från G. lucidum som hämmare av DENV-proteas och tyder på att de skulle kunna användas vid utveckling av antivirala läkemedel mot DENV-infektion.

Molekylär interaktion och MM/GBSA-analys

Med tanke på att molekylära kontakter i dockade protein-ligandkomplex kan leda till en förbättrad förståelse av molekylära mekanismer i biologiska system42 studerades också molekylär kontaktprofilering för de utvalda triterpenoiderna och referenshämmaren med DENV-proteas. NS3pro-Ganodermanontriolkomplexet uppvisade interaktion genom måttliga enkla och dubbla vätebindningar i den aktiva regionen med Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) respektive Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å). Ytterligare hydrofoba attraktioner registrerades också inom NS3pro-Ganodermanontriolkomplexet vid resterna Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 och Ala164. Resterna His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 och Gly153 uppvisade också polära respektive glycininteraktioner med Ganodermanontriol. Samtidigt registrerades också positiva (Lys73 och Lys74) och negativa laddningsinteraktioner (Asp75) med rester i NS3pro-Ganodermanontriol-komplexet (fig. 3a och b).

Interaktionsprofilerna för NS3pro-Lucidumol A återspeglade två enkla vätebindningar som bildades med resterna Asp75 (3,31 Å) och Asn152 (2,48 Å) och dubbla vätebindningar som bildades vid Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), vilket också bidrar till en glycininteraktion med rest Gly151. Dessutom loggades hydrofoba (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 och Tyr161) och polära interaktioner (His51, Ser135 och Asn152) i det dockade komplexet. Asp75 uppvisar negativa laddningsinteraktioner vid proteasets aktiva ficka med Lucidumol A (fig. 3c,d). Dessutom uppvisade dockad ganodersyra C2 komplex med NS3pro måttlig bildning av dubbla vätebindningar med Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å) medan bildning av enkla vätebindningar observerades vid resterna Trp50 (2,66 Å) och Arg54 (1,93 Å). Dessutom registrerades saltbryggbildning mellan hydroxylgruppen i ganodersyra C2 och Arg54-rester av proteaset också i detta komplex. Dessutom registrerades polära (His51- och Asn152-rester), negativa (Asp75-rester) och positiva (Arg54-rester) interaktioner i NS3pro-Ganodersyra C2-dockningen (fig. 3e och f). Det dockade komplexet NS3pro-Ganosporersyra A uppvisade tre enskilda vätebindningar som bildades vid resterna Thr120, Asn152 och Asn167, medan Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 och Ala164 markerades som uppvisande hydrofoba interaktioner (fig. 3g,h). Dessutom uppvisade den dockade NS3pro med ganosporersyra A polära (rester Thr118, Asn119, Thr120, Asn152 och Asn167), positiva (Lys73 och Lys74) och negativa laddningsinteraktioner (Asp75).

Den referenshämmare, 1,8-dihydroxy-4,5-dinitroanthrakinon, dockades också vid NS3pro-proteasets aktiva plats och betydande interaktioner registrerades. Detta komplex uppvisar enkel vätebindningsbildning vid rest Phe130, medan His51 noterades för saltbryggor och pi-pi interaktion med inhibitorn. Dessutom noterades hydrofoba (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 och Tyr151), polära (His51, Ser131 och Ser135) och glycininteraktioner (Gly151 och Gly153) i det dockade komplexet.

Det drogs slutsatsen att alla screenade triterpenoider uppvisade vätebindning med NS3pro vid den katalytiska triaden (rest His51, Asp75 och Ser135), tillsammans med några andra konserverade rester (Phe130, Tyr150, Asn152 och Gly153) som har rapporterats spela en betydande roll vid substratbindning för DENV-proteas43,44. Dessutom loggades några ytterligare rester för att dela vätebindningar med olika ligander. Dessa observationer tyder på att vätebindningar mellan en ligand och en av de katalytiska triadresterna i NS3pro kan störa elektronöverföringen mellan karboxyl- och imidazolgrupperna i Asp75- respektive His51-resterna. En sådan störning har rapporterats leda till en misslyckad nukleofil attack av hydroxylgruppen (ß-OH) i rest Ser135, som är nödvändig för att initiera proteolytisk aktivitet43,44. Därför drogs slutsatsen att de screenade triterpenoiderna kan visa stark affinitet mot NS3pro-domänen av DENV genom olika intermolekylära interaktioner och föreslog att de skulle kunna fungera som läkemedel mot DENV-infektion genom NS2B-NS3pro-hämning.

För övrigt analyserades de dockade komplexen av alla fyra triterpenoiderna, Ganodermanontriol, Lucidumol A, Ganoderic acid C2 och Ganosporeric acid A med DENV NS3pro också med hjälp av MM/GBSA-beräkningar för att beräkna bindningsaffiniteten för respektive ligander vid den aktiva platsen. Dessa beräkningar visade relativt negativa MM/GBSA-värden för alla fyra dockade komplex, dvs. NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganodersyra C2 (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganodersyra C2 (-19,735 kcal/mol).039 kcal/mol) och NS3pro-Ganosporersyra A (-11,449 kcal/mol), medan referensinhibitorkomplexet NS3pro-1,8-dihydroxy-4,5-dinitroantrakinon gav ett större värde (-38,934 kcal/mol). Dessa observationer tyder på att de utvalda triterpenoidernas hämmande aktivitet mot NS3pro kan vara svagare än referenshämmaren, men de tyder också på att ganodermanontriols starkare bindningsaffinitet med NS3pro i jämförelse med de andra triterpenoiderna stöds av de förutspådda dockningsresultaten. Dessutom visar förutsagda ΔG-värden och fysikalisk-kemiska komponenter, det vill säga ΔGBind Coulomb, ΔGBind kovalent, ΔGBind vdW (van der Waals-krafter), ΔGBind Solv SA (lösningsmedelstillgänglig yta) och ΔGBind Solv GB (solvationsenergi generaliserad Born) analys för de utvalda triterpenoiderna och den positiva kontrollen komplexerade med DENV NS3pro-protein att, beroende på ligand, ΔGBind Coulomb och/eller ΔGBind vdW bidrog mest till stabiliteten hos triterpenoid- och referensinhibitorkomplexen med DENV NS3pro-protein. (Fig. 4, S2, tabell S2). Därför drogs slutsatsen att ganodermanontriol var den mest lovande funktionella triterpenoiden för DENV NS3pro-protein och analyserades vidare tillsammans med de andra triterpenoiderna med hjälp av molekylär dynamik och in vitro-analys.

Molekylär dynamik (MD)-analys

Interaktionsinformation som förutsägs från mål-ligand beräknad med hjälp av molekylär dockning kan valideras ytterligare genom molekylär dynamiksimulering och kristallografiska studier38,41. Här utvärderades stabiliteten hos de utvalda triterpenoid-NS3pro-domänkomplexen med hjälp av 10 ns MD-simulering i termer av root mean square deviation (RMSD), root mean square fluctuation (RMSF) och analys av kontaktkartor för protein-ligand.

RMSD-analysen av C-alpha- och ryggradatomer i DENV NS3pro komplex med alla fyra liganderna visade stabila och acceptabla avvikelser under 10 ns MD-simuleringen (fig. 5). Intressant nog registrerades den sista fluktuationen för receptorn som <2 Å RMSD medan ganodermanontriolhämmaren visade en stabil och maximal variation på 6 Å i komplex med NS3pro-domänen i slutet av simuleringsintervallet (fig. 5a). RMSF som beräknades för både enskilda rester av receptorn och atomer av liganden visade också tolerabla variationer (mindre än 2,8 Å) under simuleringsintervallet (fig. S3a, S4a). Obetydliga RMSF-svängningar observerades dock också under en tidsram på 5-7 ns i keto- och metylgrupperna i ligandens cyklopenta-fenanthren-7-on-ring (fig. S3a).

På samma sätt visade RMSD-analysen för NS3pro-Lucidumol A-komplexet att både receptorn och liganden uppvisade variationer på mindre än 3 Å under 10 ns simuleringsintervallet (fig. 5b). Samtidigt förutspådde RMSF-analysen för både NS3pro och Lucidumol A variationer <3 Å, och acceptabla avvikelser registrerades också i metyl- och hydroxylgruppen i ligandens heptanregion under simuleringsintervallet på 10 ns (fig. S3b). På samma sätt uppvisade liganden i NS3pro-Ganodersyra C2-komplexet acceptabla avvikelser under de inledande 2-5 ns följt av stabilitet och den slutliga avvikelsen registrerades vid mindre än 8 Å under simuleringsintervallet på 10 ns (fig. S4b).

NS-pro-Ganodersyra C2-komplexet uppvisade också obetydliga avvikelser i receptorn mellan 2-5 ns följt av stabilitet med en slutlig variation som registrerades vid mindre än 1,75 Å under simuleringsintervallet (fig. 5c). Dessa acceptabla avvikelser i liganden (mindre än 6 Å) och receptorn (3 Å) stöddes också av den beräknade RMSF för respektive komplex (fig. S3c, S4c).

För övrigt uppvisade simuleringsanalysen av liganden i det dockade komplexet NS3pro-Ganosporeric acid A initialt en låg avvikelse under 6 ns i den karboxylgrupp som är belägen i ligandens första heptanparti, följt av att den fick ett stabilt tillstånd vid 4,6 Å RMSD fram till slutet av 10 ns-intervallet (fig. 5d). Samtidigt uppvisade NS3pro stabila svängningar runt 1,6 Å RMSD med obetydliga avvikelser i den inledande N-terminala regionen (fig. 5d). Dessa observationer tydde på stabiliteten hos respektive dockat komplex, vilket stöds av RMSF-kurvorna för enskilda rester (mindre än 3,5 Å) och atomer (3 Å) i receptorn respektive liganden (fig. S3d, S4d).

En interaktionskarta mellan protein och ligand som beskriver enskilda resters bidrag till intermolekylär bindning genererades också från simuleringens bankurvor (fig. 6). Protein-ligandinteraktionskartan för NS3pro-Ganodermanontriolkomplexet visade att Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 och Asn167 deltar i bildandet av vätebindningar, hydrofoba attraktioner, joniska interaktioner och vattenbroar (Fig. 6a). Resterna Leu149 och Asn152 lyftes fram för att bidra med framträdande vattenbryggor och vätebindningsattraktioner under simuleringsintervallet på 10 ns (fig. 6a). Residuen Asn152 förutspåddes också bilda vätebindningar i dockningskomplexet (fig. 3a, b), vilket tyder på betydelsen av denna rest i NS3pro för interaktion med Ganodermanontriol.

Interaktionskartan för NS3pro-Lucidumol A visade deltagande av His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 och Asn167 i vätebindningar, hydrofoba interaktioner och vattenbryggor, med Asp75 och Gly153 som de största bidragen i vattenbryggor respektive vätebindningsbildning (Fig. 6b). Molekylär dockningsanalys föreslog också Gly153:s roll i vätebindning med liganden (fig. 3c,d), vilket visade på betydelsen av denna rest för stabiliteten mellan protein och ligand. Dessutom indikerades Tyr161, Asp75 och Leu128 också som viktiga bidrag i vattenmedierade, vätebindande respektive hydrofoba interaktioner med denna ligand (fig. 6b). Dessa resultat tyder på att Gly153, Tyr161, Asp75 och Leu128 var starkt ansvariga för den stabila konformationen hos NS3pro-Lucidumol A-komplexet under simuleringsintervallet.

Men NS3pro-Ganodersyra C2-komplexet uppvisade bidrag från Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 och Tyr161-rester i olika molekylära interaktioner i protein-ligand-mappningen under simuleringen (Fig. 6c). Intressant nog bidrog Arg54 till den största intermolekylära interaktionen genom vätebindningsbildning följt av vattenbryggor och jonisk attraktion (fig. 6c). Denna rest förutspåddes också i den molekylära dockningsanalysen att bilda två vätebindningar med ganodersyra C2 (fig. 3e,f), vilket tyder på att den är en nyckelfaktor för att upprätthålla stabiliteten hos mål-liganden under simuleringen.

På samma sätt visade interaktionsprofilen NS3pro-Ganosporersyra A att Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 och Asn167 aktivt bidrog till vattenbroar, hydrofoba och joniska interaktioner (fig. 6d). Lys73, Lys74, Val155 och Asn167 förutspåddes dock ge de största bidragen till stabiliteten hos NS3pro komplexerad med Ganosporeric acid A ligand via vätebindningar, följt av vattenbryggor, hydrofoba och joniska interaktioner (fig. 6d). Asn167 markerades också för att uppvisa vätebindningsbildning med Ganosporersyra A i det dockade komplexet, vilket avslöjar dess betydande bidrag till komplexets stabilitet. Dessa resultat validerade och föreslog den betydande stabiliteten hos varje triterpenoid med NS3pro-domänen av DENV-proteas i dockade komplex. Därför föreslogs det återigen att dessa triterpenoider skulle kunna användas i formuleringen av läkemedel mot DENV-infektion.

Virtual world

NS2B-NS3 proteas

Virtuell screening och analys av dockningssimuleringar

Molekylär interaktion och MM/GBSA-analys

Molekylär dynamik (MD)-analys

Lämna ett svar Avbryt svar

Senaste inläggen