Abstract

Bakgrund och mål. Ett tillförlitligt icke-invasivt prediktionsverktyg för screening, diagnos och/eller stadieindelning av kolorektalcancer (CRC) före operation är avgörande för val av behandling och prognos. Metoder. Patienter som togs in för initial behandling av CRC mellan den 1 januari 2015 och den 31 december 2018 hämtades och granskades. Uppgifter om CD16+CD56+ natural killer (NK)-celler analyserades i enlighet med stadierna av CRC. Resultat. Antalet kvalificerade deltagare bland friska, stadium I, stadium II, stadium III och stadium IV CRC-patienter var 60, 66, 60, 70 respektive 68. Det fanns en signifikant skillnad i cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler mellan den friska gruppen och CRC-gruppen (), liksom mellan den friska gruppen och CRC-gruppen i stadium III eller IV ( respektive 0,001). Procentandelen cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler i lymfocyter var negativt korrelerad med förekomsten av CRC. När man jämförde gruppen av CRC-fall i stadium I och II med gruppen av CRC-fall i stadium III och IV med hjälp av cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler var arean under Receiver Operating Characteristic-kurvan 0,878. Med ett optimalt gränsvärde på 15,6 % var OR 0,06 (0,03, 0,11), , sensitiviteten 86,5 %, specificiteten 72,5 %, det positiva prediktiva värdet 74,2 % och det negativa prediktiva värdet 85,5 %. Slutsatser. Cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler kan användas som ett verktyg för screening och diagnostik/stagning av CRC.

1. Introduktion

Colorectal cancer (CRC) har en incidens på cirka en miljon per år och orsakar döden för nästan 700 000 personer varje år, vilket gör den till den fjärde mest dödliga cancern i världen . Den nuvarande screeningstrategin för CRC har låg sensitivitet och/eller specificitet i avföringsbaserade tester, tråkiga förberedelser av tarmen före röntgenundersökningar och hög risk för perforering vid endoskopiska undersökningar. Det bästa screening- och uppföljningstestet med hög följsamhet för CRC bör vara lätt att genomföra och upprepa, särskilt med tanke på att upp till 25 % av fallen är obehandlingsbara vid tidpunkten för diagnosen och att 50 % av fallen återkommer i tidiga stadier efter kirurgi .

Stadieindelningen och prognosen för CRC är huvudsakligen beroende av patologi efter kirurgiska ingrepp . En konsensus immunoscore på paraffinsektioner för klassificering och prognos av CRC var ett praktiskt exempel . Även om flera studier har använt kompletterande och icke-invasiva biomarkörer vid diagnostisering av CRC , saknas fortfarande ett tillförlitligt prediktionsverktyg med hög sensitivitet samt specificitet för diagnostisering och/eller stadieindelning av CRC före kirurgi.

Det är känt att immunsystemet är involverat i utvecklingen och utvecklingen av CRC . Immuninfiltration av olika immunceller i CRC har visat sig vara relaterad till metastasering och prognos . Dessutom kan de cirkulerande immuncellerna återspegla det lokala immunsvaret i tumörens mikromiljö , vilket ger potentiellt viktig information om sjukdomsutvecklingen i CRC . Naturliga mördarceller (NK) är en viktig delmängd av immuncellerna, vars aktivitet utlöses av en föränderlig och känslig jämvikt mellan aktiverande och hämmande signaler som tas emot av receptorer på cellytan, och anses vara intressanta måltavlor för translationella och kliniska studier .

I denna studie analyserade vi CD16 och CD56 dubbelpositiva NK-celler i friska och olika stadier av CRC-patienter före inledande behandling, och försökte ta reda på värdet av CD16+CD56+ NK-celler i prediktion och förbehandlingsstagning av CRC.

2. Metoder

Detta var en retrospektiv kohortstudie som genomfördes vid 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, ett tertiärsjukhus i nordöstra Kina. Institutionell etikkommittés godkännande erhölls före datainsamling, och informerat samtycke inhämtades från patienterna vid intagningen.

Kliniska journaler för patienter som togs in för initial behandling av CRC mellan den 1 januari 2015 och den 31 december 2018 till onkologiavdelningen hämtades och granskades. Inkluderade patienter skulle ha tillgängliga uppgifter om NK-celler före behandling (de senaste före den första operationen) samt histologiskt bekräftad primär CRC. Staging baserades på terminologin Tumor Node Metastasis (TNM) . Patienter med oklar diagnos, komplicerade med andra cancerformer, som togs in efter tidigare behandlingar för CRC, med andra kroniska sjukdomar (t.ex. kardiovaskulära sjukdomar och endokrina sjukdomar) eller med virus- eller bakterieinfektioner uteslöts. Ålders- och BMI-matchade friska deltagare (inga kliniska klagomål som just avslutat årlig fysisk undersökning vid tidpunkten för inskrivningen) skrevs in i kontrollgruppen.

Fastande perifera venösa blodprover samlades in från alla deltagare före behandling (för CRC-gruppen) eller på dagen för den årliga undersökningen (för de friska kontrollerna) i ett heparinbelagt rör och förvarades vid 2-8°C. 100 μl nyinsamlat blod överfördes till ett flödesspecifikt rör. 20 μl av ett BD Multitest 6-color TBNK-reagens (Ref # 644611, BD, USA, inklusive CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC och CD8 APC-Cy7) tillsattes för flödescytometriundersökning i enlighet med tillverkarens bruksanvisning, inom panelen där CD16+CD56+ specifikt kvantifierade NK-celler inom lymfocyternas population. Blandningen inkuberades i rumstemperatur i 15 minuter i mörker och behandlades med 2,5 ml lysisbuffert för röda blodkroppar (Sigma-Aldrich) i 10 minuter i rumstemperatur i mörker. Blandningen tvättades två gånger med PBS-buffert, resuspenderades och fixerades i 0,5 ml PBS innehållande 0,9 % formaldehyd (Sigma-Aldrich) och analyserades med hjälp av ett FACSCanto II flödescytometersystem (BD Biosciences) med hjälp av FACSDiva™ programvara version 8.0 (BD Biosciences). Minst 20 000 celler analyserades i P1 gate från varje prov.

2.1. Statistisk analys

Diskreta data uttrycktes som antal fall (procent) och analyserades med hjälp av test eller Fishers exakta test, tillsammans med oddskvot (OR) och 95 % konfidensintervall (95 % CI), beroende på vad som var tillämpligt. Kontinuerliga data visades som och analyserades med hjälp av -testet. Område under ROC-kurvan (Receiver Operating Characteristic) användes för att visa prediktionsvärdet. SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) användes för statistisk analys. En tvåsvansad anses vara signifikant annorlunda.

3. Resultat

Under den förutbestämda studieperioden togs 2 714 CRC-patienter in på vårt sjukhus. Enligt de förinställda inklusionskriterierna ingick 66 patienter i stadium I, 60 patienter i stadium II, 70 patienter i stadium III och 68 patienter i stadium IV i vår studie. Ytterligare 60 ålders- och BMI-matchade friska deltagare ingick i kontrollgruppen. Det fanns inga signifikanta skillnader i ålder, kön, kroppsvikt, längd eller BMI mellan friska kontroller och CRC-fall eller mellan olika grupper (, Tabell 1).

3.1. Det prediktiva värdet av cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler i CRC

Det fanns en signifikant skillnad i cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler mellan den friska gruppen och CRC-fallen (, Tabell 1). Procentandelen cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler i lymfocyter var negativt korrelerad med förekomsten av CRC.

ROC-kurvan (Receiver Operating Characteristic) användes för att visa CD16+CD56+ NK-cellers roll vid förutsägelse av CRC. När man jämförde friska kontroller med CRC-fall som helhet (figur 1) var arean under kurvan (AUC) 0,725 (tabell 2). Med ett optimalt gränsvärde på 19,7 % var OR 0,08 (0,04, 0,15), , sensitiviteten 80,0 %, specificiteten 76,9 %, det positiva prediktiva värdet (PPV) 44,0 % och det negativa prediktiva värdet (NPV) 94.4%.

Figur 1

ROC-kurva (Receiver Operating Characteristic) för NK-celler vid förutsägelse av CRC-fall (frisk vs. fall).

3.2. Cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler i olika stadier av CRC-fall

Det fanns inga skillnader i cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler mellan den friska gruppen och CRC-gruppen i stadie I eller II ( respektive , ), men signifikanta skillnader finns mellan den friska gruppen och CRC-gruppen i stadie III eller IV (, , respektive , , Tabell 1). Eftersom det inte fanns några skillnader i CD16+CD56+ NK-celler mellan den friska gruppen och CRC-gruppen i stadium I eller II var AUC 0,892 (tabell 2) när man jämförde gruppen friska kontroller + CRC-fall i stadium I+II med gruppen CRC-fall i stadium III+IV (figur 2). Med ett optimalt gränsvärde på 15,6 % var OR 0,07 (0,04, 0,12), känsligheten 84,4 %, specificiteten 72,5 %, PPV 80,5 % och NPV 77,5 %.

Figur 2

ROC-kurva (Receiver Operating Characteristic) för NK-celler i olika stadier av CRC-fall (friska+stadier 1&2 vs. stadium 3&4).

När man jämförde gruppen av CRC-fall i stadium I och II med gruppen av CRC-fall i stadium III och IV (figur 3) var AUC 0,878 (tabell 2). Med ett optimalt gränsvärde på 15,6 % var OR 0,06 (0,03, 0,11), känsligheten 86,5 %, specificiteten 72,5 %, PPV 74,2 % och NPV 85,5 %.

Figur 3

Receiver Operating Characteristic (ROC)-kurva för NK-celler i olika stadier av CRC-fall (stadier 1&2 vs. Steg 3&4).

4. Diskussion

Bredvid kan NK-celler delas in i CD56bright och CD56dim baserat på deras CD56-uttryck. De förstnämnda cellerna är förknippade med immunoregulering och produktion av proinflammatoriska cytokiner, medan de sistnämnda cellerna är cytotoxiska . CD16 (FcγRIII) på NK-celler förmedlar antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet , och närvaron av CD16 utesluter således att vissa NK-celler som är korrelerade med T- eller B-celler är inblandade .

Nu har man i två studier använt CD3-CD56+ som markörer för NK-celler. I en studie rapporterades förekomsten av undergrupper av NK-celler hos CRC-patienter, med slutsatsen att ”andelen CD16+ NKT-liknande celler var oberoende av varandra förknippad med kortare sjukdomsfri överlevnad hos CRC-patienter” . Författarna hade dock bara rekryterat ett begränsat antal patienter, och stratifieringen efter olika stadier samt en uppdelning av CD56bright och CD56dim NK-cellpopulationen gjorde att deras data inte var tillräckligt kraftfulla. Dessutom har en del av dessa patienter fått radiologisk behandling redan innan NK-cellerna samlades in, vilket kan ge upphov till heterogenitet (en blandning av patienter som behandlats initialt och patienter som behandlats efter behandlingen) i den sammanslagna patientpopulationen. I en annan studie rapporterades en negativ korrelation mellan perifera NK-celler och TNM-stegring av CRC, med en signifikant skillnad i NK-celler mellan friska och stadium I och II, och friska och stadium IV, men inte mellan friska och stadium III . Denna inkonsekventa trend kan bero på det lilla antalet inskrivna patienter i varje grupp. I vår studie samlade vi in fler patienter, och endast patienter utan tidigare behandling ingick i analysen, vilket kan visa det naturliga kroppstillståndet vid CRC-belastning. Således är våra data, som homogena som sådana, tillämpliga som ett screeningtest före inledande behandling.

En annan styrka i vår studie ligger i uteslutningen av fall av virus- eller bakterieinfektioner. Det finns aktiverande receptorer och hämmande receptorer på NK-cellernas yta . NK-cell-aktiverande receptorer, som exemplifierades av Ly49H, KIR2DL3 eller KIR3DS1, är nödvändiga för att klara av infektioner med cytomegalovirus , hepatit C-virus eller Epstein-Barr-virus respektive. Å andra sidan är NK-cellhämmande receptorer, t.ex. CD94-NKG2A eller KIRs , också inblandade vid virusinfektioner. Balansen mellan aktiverande och hämmande receptorer upprätthålls genom receptor-ligandbindning . Direkta tollliknande receptorer (TLR) kan aktiveras av lipopolysackarid, en komponent i gramnegativa bakterier. Stimulering av TLR på NK-celler har också rapporterats vara involverad i NK-cellernas aktivering . Därför kommer uteslutning av fall av virus- eller bakterieinfektioner att minska heterogeniteten hos dessa fall i analysen av CRC-fall.

Det har funnits rapporter om prognosen för CRC baserad på immunohistokemisk färgning för att upptäcka genmutation eller polymorfism , eller aktivering , vilket endast är genomförbart efter kirurgiska ingrepp. En kategori av cirkulerande biomarkörer för CRC faller inom ramen för genreglering (mikroRNA eller metylering) . En annan kategori är metabolomiska analyser av serum . I denna mening har de cirkulerande CD16+CD56+ NK-cellerna en förutsägande roll i både screening och stadieindelning före kirurgiska ingrepp.

5. Slutsats

Sammanfattningsvis fann vi att andelen cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler var negativt korrelerad med förekomsten av CRC och stadieindelningen av CRC. Med ett gränsvärde på 19,7 % och 15,6 % kunde procentandelen cirkulerande CD16+CD56+ NK-celler skilja mellan friska och CRC-fall eller stadium I+II respektive III+IV-fall.

Datatillgänglighet