Perforin/granzyme apoptosis pathway är den primära signalvägen som används av cytotoxiska lymfocyter för att eliminera virusinfekterade och/eller transformerade celler. Studier på genstörda möss visar att perforin i kombination med granzym kan inducera apoptos. Det är avgörande för den cytotoxiska effektorfunktionen och har en oumbärlig, men odefinierad roll i granzym-medierad apoptos.
Perforin och granzym
Perforin är ett porbildande protein och även känt som cytoplasmatiska granulatgifter. Granzym är en familj av strukturellt besläktade serinproteaser som lagras i de cytotoxiska granulerna hos cytotoxiska lymfocyter (CL). Perforin och granzym inducerar apoptos hos målcellerna tillsammans (figur 1). Granzym är nödvändigt för att utlösa apoptos hos målcellerna, men de är beroende av att perforin levererar dem på lämpligt sätt. Både perforin och granzym binds till målcellens yta som en del av ett enda makromolekylärt komplex associerat med serglycin, vilket ytterligare minskar sannolikheten för passiv diffusion av granzym.
Figur 1. Perforin och granzym inducerar målcellsapoptos i samarbete.
I människor finns granzym A, B, H, K och M, medan det i möss finns granzym A, B, C, D, E, F, G, K, L, L, M och N. Granzym A (GrA) och granzym B (GrB) är de vanligaste granzymerna och har varit de mest studerade. Granzym A och B:s funktioner för att inducera målcellsapoptos har undersökts ingående in vitro, och de är bättre förstådda än perforins roll på molekylär nivå.
Process och reglering av Perforin/Granzym Apoptosvägen
När de väl har utsöndrats av cytotoxiska lymfocyter, tränger granzymerna in i målcellerna, vilket är ett viktigt steg i celldöden. De viktigaste lytiska proteinerna som paketeras i granulerna är olika granzymer och det porbildande proteinet perforin, som underlättar cellernas internalisering av granzymer.
Granzym B utlöser huvudsakligen caspasaktivering indirekt, snarare än genom direkt caspasbearbetning. Det uppnår detta genom att direkt aktivera pro-apoptotiska ”BH3-only”-medlemmar av BCL-2-familjen, såsom BH3-interacting domain death agonist (Bid). Bid tillsammans med proapoptotiska Bax- och/eller Bak-proteiner från BCL-2-familjen leder till att proapoptotiska mitokondriella mediatorer, t.ex. cytokrom c, läcker ut i cytosolen. Cytokrom c aktiverar pro caspase-9, och genom att binda till apoptotisk proteasaktiverande faktor 1 (Apaf-1) blir pro caspase-9 till moget caspase-9, som fortsätter att bilda apoptosomen och aktiverar caspase-3 i nedströmsledet. Aktiverat caspas-3 kan klyva specifika substrat som ICAD (inhibitor of the caspase-activated DNase, CAD), vilket gör det möjligt för CAD att translokera till kärnan för att fragmentera DNA. Förutom Bid kan granzym B inaktivera Mcl-1 som är en medlem av den antiapoptotiska Bcl-2-familjen för att frigöra det pro-antiapoptotiska Bcl-2-familjeproteinet Bim på det yttre mitokondriemembranet. Granzym B kan också förmedla effektorn caspase-3 och initiatorn caspase-8 för att reglera apoptosvägen.
I motsats till granzym B är granzym M inte beroende av mitokondrierna för att reglera, men granzym M kan aktivera granzym B genom klyvning av proteinashämmare 9 (PI-9), som är granzym B-hämmare. Granzym M kan också direkt klyva ICAD för att frigöra CAD liksom granzym B.
Granzym A inducerar förlust av mitokondriernas inre membranpotential och frisättning av reaktiva syrearter (ROS). Det genererar enkelsträngade DNA-nickar snarare än oligonukleosomala DNA-fragment. Som svar på ROS translokaliseras det ER-associerade SET-komplexet, inklusive SET, Ape1, pp32, HMG2, NM23-H1 och TREX1, till kärnan, där granzym A klyver tre medlemmar av SET-komplexet som är involverade i DNA-reparation: HMG2, Ape1 och SET.
Perforin/Granzyme Apoptosis Pathway in Disease
Studier på genstörda möss visar tydligt att perforinvägen är intimt involverad i försvaret mot virala patogener och transformerade celler. Men oanade roller för perforin som en avgörande mediator i immunövervakningen av spontant transformerade celler och i regleringen av B-cellshomeostasen och T-cellsminnet har också visats in vivo. Paradoxalt nog spelar perforin en viktig roll i patogenesen för vissa autoimmuna sjukdomsmodeller, t.ex. insulinberoende diabetes hos ickeobesdiabetiska möss (NOD-möss), men det kan undertrycka andra autoimmuna sjukdomar, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE).
De perforin/granzym-apoptosvägar som reglerar granulatpolarisering och exocytos håller på att bestämmas, och dessa vägar kan störas av cancercellers interaktion med vissa cytotoxiska lymfocyter. De senaste fynden att granzym som tränger in i målceller involverar bindning till specifika membranreceptorer och att vissa tumörer syntetiserar serinproteashämmare som kan neutralisera granzymer har indikerat potentiella nya sätt för tumörer att undkomma immunförsvarets angrepp.