… (Zhang et al., 2009), orsakade allvarliga problem för karakteriseringen av proteinerna Flv4 och Flv2. Det spekulerades först att en sådan membranassociation sker via Sll0218-proteinet, som är ett integralt membranprotein med fyra predikterade transmembranhelixer. Detta visade sig dock inte vara fallet eftersom Flv4 i stort sett stannade kvar i membranfraktionen även i avsaknad av Sll0218-protein (mutanterna D fl v2 , D sll0218-19 och D sll0218- 19/ fl ag – fl v4) (data visas inte). Dessutom är Sll0218-proteinet associerat med ett stort membrankomplex oberoende av Flv2/Flv4-heterodimern ( figur 4). Slutligen, genom att modifiera tvåfaspartitioneringsmetoden för membransubfraktionering, lokaliserades Sll0218-proteinet till thylakoidmembranet, medan Flv4 och Flv2 i det systemet tenderar att associera med plasmamembranet (figur 2D). Den sistnämnda associationen verkade vara starkt katjonberoende (figurerna 2B och 2C). Ett liknande beteende rapporterades nyligen för ett annat Synechocystis-protein, även om mekanismen för membranassocieringen är oklar (Carmel et al., 2011). Baserat på Flv2/Flv4-heterodimermodellen och sekvensanpassningen kunde några förmodade metallbindningsställen med His-, Asp- och Glu-rester identifieras på proteinytan. Ytbundna metaller hittades även i homologa strukturer. Till exempel har den fl avodoxin-liknande domänen från Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) en Ca 2+ , och M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG och 1YCH) har flera Zn 2+ bundna på ytan (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Metalljonerna på strukturerna härstammar från kristalliseringslösningen, men en del av de metallbindande resterna är bevarade eller ersatta med liknande rester i vår modell (se Supplemental Table 2 online). Sammantaget kan dessa rester vara ansvariga för den katjonberoende associeringen av Flv2 och Flv4 till membranfraktionen. Baserat på analys av modellens elektrostatiska ytpotential har Flv4-monomeren en mer negativt laddad yta (figur 8B) och innehåller fler förmodade metallbindningsställen på ytan än Flv2-monomeren (se kompletterande tabell 2 online). Med hänsyn till att den katjonkoncentration som används i isoleringsbufferten är mycket högre än de verkliga fysiologiska förhållandena (figurerna 2B till 2D) kan bindningen av Flv2/Flv4 till membranet in vivo vara övergående och reversibel. Flv2/Flv4:s specialisering på plasmamembranet vid cellbrott (figur 2D) kan också relateras till dess ytladdning eftersom plasmamembranets inre yta är mer negativ än thylakoidmembranet med höger sida ut (Barber, 1982; Körner et al., 1985). Ytladdningen av thylakoidmembranet kan dock ändras dramatiskt under fotosyntesen, vilket kan förmedla transitbindning av Flv2/Flv4 även med thylakoidmembranet. Sll0218-proteinet lokaliserades entydigt till ett komplex med hög molekylmassa i thylakoidmembranet. Det märkliga beteendet hos Sll0218-proteinet i det konventionella tvåfasfördelningssystemet för membransubfraktionerna tyder dock på att Sll0218-proteinet inte är jämnt fördelat i thylakoidmembranet. Det är associerat med ett stort komplex, som bara är marginellt mindre än den stora PSII-dimeren. De- creation av förhållandet mellan PSII-dimer- och PSII-monomerkomplexen sker endast i de mutanter som saknar Sll0218-proteinet ( D sll0218-19 och D fl v4 ), men inte i D fl v2 (figur 5, tabell 1). Därför postulerar vi att Sll0218 kan fungera som en chaperon i stabiliseringen av PSII-dimeren som monteras under förhållanden med luftnivå av CO 2 . Även om PSII-komplexet har isolerats både i monomer och dimer form (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009) är det allmänt accepterat att PSII-komplexet in vivo fungerar som en dimer i cyanobakterier såväl som i högre växter (Hankamer et al, 1999; Kuhl et al., 2000), medan det monomera PSII kan vara ett mellanting vid normal sammansättning och reparation av PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Även om dimeriseringen in vivo av PSII i cyanobakterier har ifrågasatts på grund av användningen av detergenter för solubilisering och in vitro-analys av thylakoidkomplexen (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), finns det övertygande bevis för dimerbildning med hjälp av mutantmetoder. Faktum är att de små PSII-subenheterna PsbM och PsbT, som ligger i monomer-monomergränssnittet, har visat sig vara avgörande för korrekt sammansättning och reparation av PSII (Ohnishi och Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Eftersom Sll0218-proteinet endast uttrycks under låga (dvs. luftnivå) CO 2-förhållanden, postulerar vi att sammansättningen av PSII-dimerer skiljer sig åt beroende på närvaron eller frånvaron av Sll0218-proteinerna (se nedan). Optimering av fotosyntesen kräver strikt reglering mellan absorption och omvandling av solenergi till kemisk energi och dess utnyttjande av nedströms metaboliska vägar. För vattenlevande fotoautotrofa organismer, t.ex. cyanobakterier, är CO 2 ett viktigt men ofta otillräckligt substrat. I naturliga miljöer leder otillräcklig tillgång till CO 2 , särskilt i kombination med hög strålning, till ett högt excitationstryck på fotosystemen (Huner, 1998) och begränsar fotosyntesens hastighet. För att hantera detta induceras flera CO 2 -koncentreringsmekanismer kraftigt vid låga Ci-förhållanden i cyanobakterier för att öka CO 2 -koncentrationen runt ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas/oxygenas och samtidigt inducera cyklisk elektronflöde för att generera mer ATP (granskad i Kaplan och Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Mikroarray- och proteomstudier har avslöjat ett stimulon med låg CO 2 -nivå (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), som också innefattar operonet sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ), som regleras lika starkt som de inducerbara CO 2 -koncentreringsmekanismgenerna. Generna fl v2 och fl v4 har också en hög ljusrespons (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). De inaktiverade mutanterna fl v4 och fl v2 visade en hög känslighet för fotoinhibering av PSII under luftnivå av CO 2 -förhållanden (Zhang et al., 2009). Dessutom visade våra nyligen genomförda studier av operonets uttryck att operonet fl v4- fl v2 regleras noggrant av små regulatoriska RNA (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess och E.-M. Aro, opublicerade uppgifter). En sådan stark induktion och reglering av antisense-RNA av fl v4- fl v2-operonet tillsammans med observerat skydd av PSII under luftnivå av CO och hög …