Bakgrundsinformation
DNA-transfektion genom elektroporation är en etablerad teknik som kan tillämpas på kanske alla celltyper. Den ger en hög frekvens av stabila transformanter och har en hög effektivitet när det gäller övergående genuttryck. Elektroporation har nu visat sig vara effektiv för att leverera plasmid-DNA in vivo till en mängd olika vävnadstyper. Elektroporation utnyttjar det faktum att cellmembranet fungerar som en elektrisk kondensator som inte kan släppa igenom ström (utom genom jonkanaler). Om membranen utsätts för ett elektriskt högspänningsfält bryts de tillfälligt ner och det bildas porer som är tillräckligt stora för att makromolekyler (liksom mindre molekyler, t.ex. ATP) ska kunna komma in i eller ut ur cellen. Återförslutningen av membranporerna är en naturlig nedbrytningsprocess som fördröjs vid 0 °C.
Under den tid som porerna är öppna kan nukleinsyra tränga in i cellen och slutligen i kärnan. Linjärt DNA med fria ändar är mer rekombinogent och har större sannolikhet att integreras i värdkromosomen för att ge stabila transformanter. Superlindat DNA paketeras lättare i kromatin och är i allmänhet effektivare för övergående genuttryck.
Användningen av elektriska högspänningsstötar för att föra in DNA i celler utfördes först av Wong och Neumann med hjälp av fibroblaster (Wong och Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Tekniken generaliserades sedan (Potter et al., 1984) till alla celltyper – även sådana som lymfocyter som till skillnad från fibroblaster inte kan transfekteras med andra förfaranden (t.ex, Kalciumfosfat eller DEAE-dextran DNA-koprecipitat).
Oliver Smithies och kollegor använde sedan elektroporation för att föra in DNA i embryonala stamceller (ES-celler) och utformade målvektorer som gjorde det möjligt för det införda DNA:t att rekombineras med homologa regioner i arvsmassan och antingen föra in en förändrad gen eller en störande sekvens för att generera ES-celler med en specifik gen som är ”knockad in” eller ”knockad out”. De förändrade ES-cellerna användes sedan för att generera motsvarande knockin- eller knockout-möss. Elektroporation behövdes för dessa genöverföringstillämpningar eftersom den introducerar DNA i cellerna i naken form som lätt kan delta i homolog rekombination. Denna utvidgning av elektroporation ledde till att dr Smithies fick dela på 2007 års Nobelpris i medicin eller fysiologi. Metodiken för elektroporering av ES-celler är i huvudsak densamma som för andra däggdjursceller. Om homolog genersättning önskas måste vektorer som möjliggör ”positiv-negativ” screening utformas (Bronson och Smithies, 1994; Joyner 2000) så att det ena urvalet återvinner alla celler där det elektroporerade DNA:t har infogats i arvsmassan, och det andra urvalet är mot ES-kloner där DNA:t har infogats slumpmässigt. Knockin/out-möss kan sedan genereras genom att fusionera de utvalda klonade ES-cellerna med embryon, återimplantera för att möjliggöra utveckling och avla de resulterande chimärerna för att generera möss där alla celler bär på den förändrade genen.
Men även om hela plantor eller bladvävnad har rapporterats kunna transfekteras med hjälp av elektroporation måste växtcellerna i allmänhet göras om till protoplaster innan DNA lätt kan föras in i dem (alternativt protokoll; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). I likhet med däggdjursceller kan växtprotoplaster elektroporteras under olika elektriska förhållanden (kritiska parametrar). Både hög spänning med låg kapacitans (kort pulsvaraktighet) och låg spänning med hög kapacitans (lång pulsvaraktighet) har använts för att uppnå framgångsrik genöverföring (Chu et al., 1991). In vivo EP användes ursprungligen för att leverera kemoterapeutiska medel till solida tumörer och har utvecklats från prekliniska studier till kliniska prövningar (Gothelf, et al., 2003). Leverans in vivo av plasmid-DNA med hjälp av elektroporation rapporterades först i början och mitten av 1990-talet (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) och var ett logiskt framsteg baserat på framgångarna med in vitro-transfektioner med hjälp av elektroporation och påvisandet av att förfarandet kunde utföras på ett säkert sätt in vivo när det gällde att leverera små molekyler, som t.ex. kemoterapeutiska medel. Användningen av elektroporation in vivo för leverans av plasmid-DNA har sett en enorm tillväxt i antalet prekliniska studier som genomförts och har nyligen överförts till kliniken (Heller, et al., 2006a och Bodles-Brakhop, et al.,2009).
Den breda användningen av elektroporation har möjliggjorts till stor del av att det finns tillgång till kommersiella apparater som är säkra och enkla att använda och som ger extremt reproducerbara resultat. Utformningen av dessa apparater varierar avsevärt, men faller in i två grundläggande kategorier som använder olika sätt att styra pulsvaraktighet och spänning (de två elektriska parametrar som styr porbildningen). Den ena typen använder ett kondensatorurladdningssystem för att generera en exponentiellt avklingande strömpuls, och den andra genererar en riktig fyrkantsvåg (eller en approximation av denna). Kondensatoravladdningsinstrumenten laddar sin interna kondensator till en viss spänning och avger den sedan genom cell-DNA-suspensionen. Både kondensatorns storlek och spänningen kan varieras. Eftersom strömpulsen är en exponentiellt avklingande funktion av (1) den ursprungliga spänningen, (2) instrumentets kondensatorinställning och (3) kretsens motstånd (inklusive provet), kommer en ändring av kondensatorstorleken så att mer (eller mindre) laddning kan lagras vid spänningen att resultera i längre (eller kortare) avklingningstider och därmed i en annan effektiv pulsduration. Kvadratvågsgeneratorer däremot kontrollerar både spänningen och pulslängden med hjälp av fasta omkopplingsanordningar. De kan också producera snabbt upprepade pulser. För in vivo-tillämpningar är fyrkantsgeneratorer att föredra. Förutom pulsvaraktighet och amplitud påverkar även pulsantalet och elektrodkonfigurationen leveransens effektivitet.
De flesta av våra in vitro-elektroporationsexperiment har använt Bio-Rad Gene Pulser, en kondensatorurladdningsanordning, men kan direkt tillämpas på andra kondensatorurladdningsanordningar och, med viss anpassning, på fyrkantsvågsgeneratorer. Kondensatoravladdningsanordningar finns också tillgängliga från GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific och International Biotechnologies (se bilaga 4 för leverantörernas adresser). Dessa maskiner kan, antingen i en enda enhet eller genom tilläggskomponenter, leverera en mängd olika elektroporationsförhållanden som är lämpliga för de flesta tillämpningar. Kvadratvågsgeneratorer finns tillgängliga från BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan och IGEA och ger stor kontroll över pulsbredden, möjliggör flera snabba pulser och kan vara mer effektiva för celler som är mycket känsliga eller på annat sätt svåra att transfektera. Om man använder elektroporation för att utföra genterapi på levande djur eller människor krävs också god kontroll över elektroporationsparametrarna för att säkerställa effektiv DNA-överföring med minimal vävnadsskada, och detta kräver i allmänhet fyrkantsgeneratorer. Det finns generatorer som kan ge pulser som antingen konstant spänning eller konstant ström. Förutom att leverera fyrkantsgeneratorer finns elektroder som är lämpliga för in vivo-elektroporation också tillgängliga från dessa leverantörer. Dessa maskiner är i allmänhet dyrare. Det har blivit uppenbart att växelströmspulser vid ~100 kHz kan vara den mest effektiva vågformen för elektroporation och eventuellt elektrofusion (Chang, 1989).
Majoriteten av våra in vivo-experiment har använt BTX T820- eller T830-kvadratvågsgeneratorer. I dessa experiment har man använt kommersiellt tillgängliga elektroder, t.ex. en 2-nålsarray, kaliperelektroder och tångelektroder, samt specialkonstruerade elektroder. Som nämnts ovan har de största leverantörerna av elektroporationsutrustning en mängd olika penetrerande och icke penetrerande elektroder tillgängliga. Kvadratvågsgeneratorer ger bättre kontroll över pulsparametrarna, vilket är särskilt viktigt när man utför in vivo-leveranser. Den ökande användningen av in vivo-elektroporation är direkt relaterad till dess effektiva leverans till muskler. Tillämpningen av intramuskulär leverans av gener med hjälp av elektroporation har varit särskilt viktig för vaccinationsändamål (Abdulhagg, et al., 2008). Muskler har också visat sig vara en utmärkt depå för genbaserade proteinersättningstillämpningar (Trollet, et al., 2006). Leverans till muskler kan också användas för leverans av vacciner mot cancer (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Leverans till huden har också fått acceptans som ett mångsidigt mål. Leverans till huden kan användas för att behandla kutsjukdomar direkt, leverera proteiner till cirkulationen för systemisk behandling, cancerbehandling och för att leverera DNA-vacciner (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Elektroporation kan vara lättare att utföra än alternativa tekniker, vilket är anledningen till att den blir alltmer använd. Dess nackdel för användning vid transientanalys är att det behövs nästan fem gånger fler celler och DNA än vid antingen kalciumfosfat- eller DEAE-dextran-medierad transfektion (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Den största skillnaden mellan elektroporation och kalciumfosfatkoprecipitationsförfaranden är tillståndet hos det integrerade DNA:t efter selektion i lämpliga antibiotiska medier. När det gäller kalciumfosfat är mängden DNA som tas upp och integreras i arvsmassan i varje transfekterad cell i storleksordningen 3 × 106 bp. Därför integreras det transfekterade DNA:t ofta som stora tandemarrays som innehåller många kopior av det transfekterade DNA:t. Detta skulle vara en fördel när man vill transfektera genomiskt DNA till mottagarceller och selektera för någon fenotypisk förändring, t.ex. malign omvandling; här är en stor mängd integrerat DNA per mottagarcell nödvändig. Elektroporation kan däremot justeras så att den resulterar i en till många kopior av insatt DNA per mottagarcell. Detta skulle vara en fördel för studier av genuttryck, eftersom identiteten hos den specifika kopia som är ansvarig för genuttrycket kan kontrolleras, och, som diskuterats ovan, är viktigt för genmålning av ES-celler för att generera transgena möss.