Infektion med Giardia lamblia är en av de vanligaste orsakerna till diarrésjukdomar i världen (22). Denna protozoiska patogen koloniserar tunntarmen och kan fästa vid epitelet men invaderar inte slemhinnan. Infektioner är normalt självbegränsande, eftersom immunkompetenta värdar kan kontrollera och vanligtvis utrota G. lamblia, en process som involverar CD4 T-celler och generering av sekretoriskt immunoglobulin A (IgA) och andra, dåligt förstådda effektorer (6, 8, 9, 18). Trots de ofta allvarliga kliniska symptomen, diarré, buksmärtor, malabsorption och viktminskning, åtföljs infektionen inte av någon betydande slemhinneinflammation (12). Dessa observationer tyder på att inflammatoriska mediatorer kanske inte är viktiga för parasitinducerad diarré, även om de mekanismer som styr diarré vid giardiasis är dåligt kända. Giardia har inte visat sig frisätta enterotoxiner som skulle kunna förklara störningen av intestinal vätskeabsorption eller sekretion. En minskning av absorptionsytan på grund av en förlust av epiteliala mikrovilli inträffar vid Giardiainfektion hos möss (16), vilket skulle kunna leda till osmotiskt driven diarré i samband med malabsorption, men den absoluta ytminskningen är blygsam jämfört med tunntarmens förutspådda anatomiska reserv. Människor som infekterats med G. lamblia uppvisar tecken på intestinal hypermotilitet vid radiologisk undersökning (15), ett fenomen som också observerats hos experimentellt infekterade mongoliska gerbiler (5). De bakomliggande mekanismerna och den funktionella betydelsen av dessa fynd är för närvarande oklara. Målet med denna studie var därför att testa hypotesen att intestinal hypermotilitet utgör en försvarsmekanism hos värden mot Giardia, med hjälp av murinmodeller av giardiasis.

Vuxna C57BL/6-, SCID- och neuronala kväveoxidsyntes (nNOS)-deficienta möss erhölls från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). För infektioner med Giardia muris renades cystorna med hjälp av sackarosflotation, räknades i en hemocytometer under ett fas-kontrastmikroskop och gavs genom oral giva i vatten med 104 cystor/mus i 0,2 ml (9). För G. lamblia-infektioner odlades trophozoiter av GS/M-stammen (ATCC 50580) (11) i TYIS-33-medium och gavs genom oral givage med 107 cystor/mus i 0,2 ml av samma medium (9). Småintestinal motilitet bestämdes med hjälp av en modifierad testmåltidsmetod. Möss fastade över natten och fick 0,2 ml av en suspension av 106 fluorescerande polystyrenpärlor (Fluoresbrite YG-carboxylatmikrosfärer med 10 μm diameter; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) och 6 % karminfärgämne i 5 % gummi arabicum i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter 20 minuter avlägsnades tunntarmen snabbt och positionen för karminfärgningsfronten och tunntarmens hela längd registrerades. Tarmen delades sedan i åtta lika stora bitar, som var och en öppnades på längden, placerades i 2 ml PBS och kyldes på is i 10 minuter. Blandningarna skakades kraftigt för att lossa trophozoiterna och pärlorna, som sedan räknades separat med hjälp av fas-kontrast- respektive fluorescensmikroskop. Den sträcka som karminfärgningsfronten färdades på uttrycktes i procent av tunntarmens hela längd. Antalet pärlor per segment uttrycktes i procent av det totala antalet pärlor i tunntarmen. För att bedöma konsekvenserna av att hämma tunntarmens motilitet på giardial clearance infekterades möss först oralt med G. muris eller G. lamblia GS/M och behandlades genom oral gavage varannan dag, med början på dag 7 respektive dag 4, med 30 mg/kg loperamid eller med PBS som kontroll. Antalet trophozoiter i tunntarmen bestämdes på dag 21 för G. muris och på dag 9 för G. lamblia.

För att avgöra om normala vuxna möss är en lämplig modell för att studera den roll som tarmmotilitet spelar för att kontrollera giardiainfektion, infekterade vi 8-10 veckor gamla C57BL/6-möss med cystor av den naturligt förekommande murina patogenen G. muris. Den smaltarmiga motiliteten bestämdes med hjälp av en testmjölsmetod där man använde karminfärgämne som en markör för flytande fas (14) och 10-μm polystyrenpärlor som en markör för partiklar som är jämförbara i storlek med Giardia trophozoiter (19). Infektion med G. muris påskyndade transiteringen i tunntarmen, eftersom fronterna av både karminfärgämnet (Fig. (Fig.1A)1A) och polystyrenpärlorna (Fig. (Fig.1B)1B) hade färdats betydligt längre i infekterade möss än i oinfekterade kontroller. En analys av tidsförloppet av detta fenomen visade att hypermotiliteten uppstod inom en vecka efter infektionen men nådde sin kulmen vid 2 till 3 veckor, vid en tidpunkt då antalet trophozoiter minskade jämfört med antalet vid tidpunkten för maximal infektion vid 1 vecka (Fig. (Fig. (Fig.1A).1A). Således var de maximala förändringarna i smådjursmotilitet fördröjda i förhållande till toppen i trophozoitbördan, vilket tyder på att dessa förändringar kan orsakas av en annan mekanism än direkt giardial stimulering.

Detta fynd påminner om rapporter om Giardia-inducerad förlust av tarmepiteliska mikrovilli där värdets adaptiva immunsvar befanns vara ansvarigt (16, 17). För att utvärdera om liknande mekanismer kan vara inblandade i orsakandet av tunntarmens hypermotilitet utvärderade vi möss med svår kombinerad immunbrist (SCID-möss). Dessa möss saknar funktionella T- och B-celler på grund av en defekt i den katalytiska underenheten av DNA-beroende proteinkinas, PRKDC, som krävs för normal V(D)J-rekombination, och kan inte utrota Giardia (9, 18). G. muris-infektion av SCID-möss förändrade inte den småintestinala transiten, vilket stod i skarp kontrast till observationerna hos de immunkompetenta kontrollerna (Fig. (Fig.2).2). Dessa resultat tyder på att giardiasis-associerad småintestinal hypermotilitet var beroende av induktionen av ett normalt adaptivt immunsvar mot patogenen.

För att testa om den observerade småintestinala hypermotiliteten bidrog till clearance av Giardia behandlade vi möss med loperamid, ett läkemedel som hämmar tarmtransit genom att aktivera μ-opioidreceptorer i mag-tarmkanalen (2, 13, 21). Läkemedelsbehandlingen inleddes vid tidpunkten för den högsta G. muris-infektionen (dag 7) för att säkerställa att farmakologiskt inducerade förändringar i motiliteten inte skulle störa den initiala etableringen av infektionen. Hämningen av den småintestinala motiliteten med loperamid försämrade markant giardial clearance, med 25-faldigt högre antal trophozoiter hos loperamidbehandlade möss än hos PBS-behandlade kontroller efter 21 dagar (Fig. (Fig.3).3). Loperamidbehandlingen hade ingen effekt på utvecklingen av adaptiv immunitet, eftersom titrarna av antigiardialt IgA i tarmslemhinnesekret inte påverkades av behandlingen (data visas inte). Dessutom visade denna experimentella strategi en liknande hämmande effekt på murininfektion med G. lamblia GS/M, en human giardialpatogen som kan infektera normala vuxna möss (3, 9). Möss som behandlades med PBS hade i stort sett klarat av infektionen efter 9 dagar, medan möss som behandlades med loperamid från och med dag 4 fortsatte att ha ett betydande antal G. lamblia trophozoiter i tunntarmen (Fig. (Fig.3).3). Hämning av tunntarmens motilitet äventyrade således clearance av Giardia i murinvärden, oberoende av giardiaarten. Som ett ytterligare tillvägagångssätt för att fastställa betydelsen av tarmmotilitet i det antigiardiella värdförsvaret använde vi ett genetiskt tillvägagångssätt där störning av genen för nNOS stör den effektiva framdrivningen i tarmen hos möss (20). Motilitetsanalyser bekräftade att nNOS-defekta möss uppvisade en konstitutiv fördröjning av gastrointestinal transit jämfört med deras kullsyskon av vildtyp (Fig. (Fig.4A).4A). Parallellt misslyckades knockoutmössen med att rensa ut G. lambliainfektioner normalt (Fig. (Fig.4B).4B). Med hjälp av farmakologiska och genetiska metoder fann vi således att minskad tarmmotilitet var förknippad med försämring av värdens försvar mot Giardia.

Vår studie visar att tarmens hypermotilitet är ett viktigt värdförsvar mot Giardia, en slutsats som också dras i en annan färsk rapport (10). Detta försvar verkar vara beroende av utvecklingen av ett normalt adaptivt immunsvar mot parasiten, eftersom det inte förekom hos möss som saknade T- och B-celler, även om det i princip är möjligt att T- eller B-celler bidrar till hypermotilitet oberoende av deras roll i den adaptiva antigiardiella immuniteten. Immunberoende hypermotilitet fungerar i värdförsvaret mot andra enteriska parasiter, särskilt helminter. Utrotning av rundmasken Trichinella spiralis, som tillbringar en betydande del av sin livscykel i tunntarmen, är till exempel starkt korrelerad med ökad tarmmotilitet (4, 23). På samma sätt åtföljs utdrivning av krokmasken Nippostrongylus brasiliensis hos råttor av hypermotilitet i tunntarmen, vilket tyder på att den spelar en roll i värdens försvar mot denna helminth (7). Gemensamt för alla dessa enteriska patogener är deras primära, om inte exklusiva, lokalisering i tarmlumen. Sett ur anatomisk synvinkel ligger denna infektionsplats utanför den epitelklädda egentliga kroppen och är därför inte lätt tillgänglig för många immuneffektorceller och molekyler, t.ex. neutrofiler eller komplement, som verkar effektivt i kroppen. Ett effektivt antimikrobiellt försvar i tarmlumen utgör faktiskt en särskild utmaning för värden, som har en begränsad repertoar av försvarsmekanismer på denna plats. Av dessa anses allmänt sekretoriskt IgA vara en viktig luminal försvarsmekanism, men dess faktiska betydelse för giardial clearance tycks vara varierande och kan bero på dåligt definierade värd- och parasitfaktorer (6, 9, 18). Våra data och tidigare arbete med helminter (4, 23) tyder på att intestinal hypermotilitet är en annan viktig försvarsmekanism mot kolonisering av tarmlumen.

Immunberoende hypermotilitet kan ge en mekanistisk förklaring till den diarré som förknippas med giardiasis, vilket noterats i tidigare rapporter (5, 15). I princip kan diarré orsakas av minskad vätskeabsorption eller ökad sekretion eller en kombination av dessa två mekanismer. Det finns få bevis för ökad jon- och vätskeutsöndring vid giardiasis, vilket gör att försämrad vätskeabsorption är den troliga orsaken. Kortare kontakttid med luminala vätskor, som kan vara intagna eller härröra från mag- eller bukspottkörtelsekret, skulle förväntas äventyra effektiviteten av jontransporten genom epitelet, särskilt när hypermotilitet kombineras med den rapporterade förlusten av absorberande epitelytor (16). Det måste dock noteras att möss inte uppvisar öppen diarré vid Giardiainfektion. Det är ändå möjligt att en obalans i tarmvätskan förekommer hos både människor och djurvärdar och att den förblir kompenserad hos möss men inte hos människor. Om hypermotilitet verkligen bidrar till patogenesen av diarré, skulle vårt resultat att SCID-möss inte uppvisar Giardia-inducerad hypermotilitet innebära att patienter med cellulär immunbrist som förknippas med ökad känslighet för Giardia-infektioner (t.ex. kronisk variabel immunbrist) kan vara mindre benägna att utveckla infektionsassocierad diarré. Dessutom tyder våra resultat på att försiktighet är påkallad när man överväger att använda tarmmotilitetshämmare vid behandling av Giardia-inducerad diarré (1), eftersom sådan behandling kan förlänga den underliggande infektionen.