3.4 Inosinmodifiering och mRNA-omsättning
Modifiering av mRNA från adenosin till inosin (A-I) katalyseras av adenosindeaminaser som verkar på RNA-enzymer (ADARs). Dessa enzymer har en preferens för dubbelsträngade RNA-regioner, och omvandlingen av A-I (även beskriven som redigering i detta avsnitt) kommer att förändra basparningsegenskaperna hos de modifierade baserna, eftersom de nu kommer att basparras på samma sätt som guanin. På samma sätt som tidigare kommer vi att skilja de direkta effekterna av inosin på mRNA-stabiliteten från de effekter som beror på indirekta effekter. Införande av inosin i dubbelsträngade områden av RNA kan utlösa nedbrytning genom rekrytering av ribonukleaser som är specifika för inosininnehållande RNA. Det första enzym som föreslås förmedla denna effekt är Tudor-staphylococka-nukleaset (SN), som visade sig främja klyvning av hyperediterat dubbelsträngat RNA i extrakt . De flesta av de resultat som beskrivs i denna studie visar en biokemisk aktivitet för Tudor-SN på hyperediterade substrat in vitro. Det är dock oklart från dessa studier hur stor andel av mRNA som innehåller inosin som är föremål för klyvning av Tudor-SN in vivo, och om Tudor-SN var det direkta endonukleaset eller inte. Tudor-SN har visat sig vara lokaliserad i cytoplasmatiska stressgranuler , så det är möjligt att vissa av dess måltranskripter kan vara preferentiellt reglerade under stressförhållanden. Det andra nukleas som är känt för att vara specifikt för inosininnehållande RNA är humant endonukleas V (hEndoV), som kan klyva en mängd inosininnehållande RNA-substrat in vitro . I en studie föreslogs att hEndoV är det egentliga inosinendonukleaset, med Tudor-SN som ger en stimulerande aktivitet till hEndoV . Intressant nog lokaliseras hEndoV också till cytoplasmatiska stressgranuler , vilket tyder på en funktion som liknar Tudor-SN i en potentiell reglering av nivåerna av inosininnehållande mRNA under stress. Även om det står klart att det finns inosinspecifika nukleasaktiviteter i eukaryota celler (fig. 5), är deras bidrag till klyvning och omsättning av mRNA fortfarande dåligt förstått. Därför måste den fysiologiska effekten av klyvningen av hyperediterat dsRNA av Tudor-SN och/eller hEndoV undersökas mer ingående.
ADAR-enzymer kan också spela en viktig roll för mRNA-stabiliteten genom att reglera bindningen av RNA-bindande proteiner som påverkar mRNA-sönderfallet. ADAR-enzymernas inflytande på nivån av deras mål-mRNA mättes globalt, och i allmänhet korrelerar deras inverkan på mRNA-nivåerna inte väl med deras förmåga att främja inosinbildning i dessa mRNA:er . Det verkar snarare som om ADARs huvudsakliga inverkan på mRNA:s stabilitet sker genom rekrytering av det RNA-bindande proteinet HuR (ELAVL1), som är en viktig regulator av mRNA:s nedbrytning. ADAR1 interagerar med HuR på ett RNA-beroende sätt, och de flesta mRNA som nedregleras i frånvaro av ADAR1 innehåller HuR-bindningsställen . ADAR1 verkar alltså påverka stabiliteten hos sina mRNA-mål genom rekrytering av HuR till målplatser som ligger i närheten. ADARs kan också reglera nivåerna av flera mRNAs och ncRNAs genom att förhindra bindningen av nedbrytningsfaktorn PARN, som är ett poly(A)-specifikt nukleas . Denna funktion verkar också vara oberoende av redigering, eftersom en katalytiskt inaktiv ADAR-mutant kan uppfylla enzymets funktioner när det gäller att kontrollera sönderfallet. ADARs inverkan på stabiliteten hos sina mRNA-mål tycks alltså till största delen vara oberoende av deras förmåga att främja bildandet av inosin.
En viktig konsekvens av inosinmodifiering på mRNA-omsättningen beror på inosins inverkan på mikroRNA-medierad genreglering. Närvaron av inosin kan påverka två viktiga steg i denna väg: (i) biogenesen av mikroRNA och (ii) specificiteten hos mikroRNA:s inriktning på mRNA. När det gäller inosins inverkan på mikroRNAs biogenes har det visats att primära prekursorer av mikroRNAs kan redigeras av ADAR1 eller ADAR2 . Närvaron av inosin i dessa prekursorer har två skadliga effekter på produktionen av mogna mikroRNA . För det första minskar inosin effektiviteten i bearbetningen av de primära prekursorerna av Drosha, och för det andra blir inosinhaltiga prekursorer nu ett mål för inosinspecifika ribonukleaser som Tudor-SN och/eller hEndoV. Dessa kombinerade effekter av inosinmodifiering på de primära prekursorerna av mikroRNAs resulterar i en minskning av nivåerna av mikroRNAs som produceras från dessa prekursorer, med en samtidig ökning av mål-mRNAs. Denna process kan regleras, eftersom prekursorer av mikroRNA miR-151 visades redigeras under tidig utveckling, vilket resulterar i nedbrytning av prekursorer av Tudor-SN . Mer generellt bryts prekursorer av mikroRNA som innehåller inosin ned under postzygotiska stadier hos möss . Dessa resultat visar att A-I-redigering av mikroRNA-prekursorer kan reglera deras biogenes under utvecklingen, vilket i sin tur direkt påverkar uttrycket av deras mRNA-mål. Ändå är ADARs effekt på mikroRNA-biogenesen komplex eftersom ADAR1 också visades heterodimerisera med RNase III-enzymet Dicer för att öka effektiviteten av mikroRNA-bearbetningen , och därmed spela en positiv roll i mikroRNA-biogenesen. Komplexiteten hos ADARs direkta och indirekta effekter på små RNA-biogenesen visades också genomgående i Caenorhabditis elegans. Slutligen kan ADAR1 också binda siRNAs oberoende av RNA-redigering i däggdjursceller, vilket begränsar effekten av siRNA-behandling . ADARs verkar därför vara ett tveeggat svärd för mikroRNA- och små RNA-medierad genlindring, eftersom inosinmodifieringens undertryckande effekt på bearbetning och stabilitet av mikroRNA-prekursorer kan uppvägas av ADARs förmåga att främja bearbetningen av mikroRNA genom sin förening med Dicer och sin effekt på siRNA-tillgängligheten. Icke desto mindre spelar dessa enzymer viktiga funktioner när det gäller att kontrollera cellulär differentiering genom redigering av mikroRNA-prekursorer. Till exempel visades hypereditering av mikroRNA-prekursorn Let-7 av ADAR1 i leukemi främja förnyelse av leukemistamceller , vilket belyser vikten av att finjustera redigeringen av mikroRNA-prekursorer under celldifferentiering.
Inosin påverkar också den mikroRNA-medierade mRNA-regleringen genom att påverka bildandet av RNA-duplexer, vilket är kritiskt när det gäller att bestämma specificiteten hos interaktionerna mellan mikroRNA:s och mRNA:s (fig. 5). Detta visades först genom att visa att införandet av inosin i mikroRNA miR-376 resulterade i repression av en annan grupp mRNA:er i förhållande till dem som reprimerades av det omodifierade miR-376 . Om den redigerade platsen finns i mikroRNA:s frösekvens resulterar modifieringen i en förändring av mikroRNA:s specificitet eftersom inosin företrädesvis basparar sig med C. Omvänt kommer A-I-redigering i 3′-UTR-sekvenser av mRNA:er att förändra mikroRNA:s potentiella målinriktning för dessa UTR:er och kan skapa nya mikroRNA-bindningsställen . Reglerad redigering har visat sig vara potentiellt viktig för regleringen av onkogener och tumörsuppressorgener genom mikroRNA under cellulär omvandling .
Finalt kan inosin påverka mRNA-stabiliteten genom indirekta effekter. Inosininnehållande mRNA har visat sig vara begränsade till kärnan i LPS-stimulerade immunceller , vilket förhindrar att de exponeras för det cytoplasmatiska mRNA-sönderfallsmaskineriet. Om dessa mRNA:er hålls kvar i kärnan skulle de dock utsättas för prioriterad nedbrytning genom nukleära nedbrytningsvägar, t.ex. den nukleära exosomen. Detta kan leda till ökad eller minskad stabilitet, beroende på den relativa effektiviteten hos var och en av dessa nedbrytningsvägar för specifika mRNA:er. Inosin påverkar också alternativ splicing, vilket i sin tur skulle kunna resultera i mRNA-isoformer med olika stabilitet. Detta gäller särskilt om de alternativt splicade arterna innehåller bindningsställen för olika RNA-bindande proteiner som modulerar deras stabilitet. Därför kan inosin och ADARs påverka mRNA:s stabilitet och uttryck på många sätt genom en kombination av både direkta och indirekta effekter.