Identifiering av H2N3-influensa A-virus från svin i USA

Skriven av den i Articles

Resultat

Analys av kliniska prover.

I september 2006 isolerades influensaviruset A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) från flera 5- till 6-veckorssvin med multifokal bronkopneumoni vid en kommersiell svinskötselanläggning med flera olika leverantörer. Lungelesionerna omfattade måttlig, subakut till kronisk, purulent bronkopneumoni och interstitiell pneumoni med bronkiolit och peribronchit. Lungvävnad var negativ för PRRSV (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), PCV2 (porcine circovirus type 2) och Mycoplasma hyopneumoniae men var positiv för Streptococcus suis. På grund av de karakteristiska influensaliknande lesionerna och de kliniska tecknen på lunginflammation inokulerades homogenat av lungvävnad på Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler. Cytopatiska effekter upptäcktes dag 3 efter inokulering (p.i.). Influensavirusets nukleoprotein (NP)-gen påvisades i de infekterade cellerna genom RT-PCR. Viruset reagerade inte med referenssera från svin (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) i hemagglutinationsinhibitionsanalyser (HI-analyser), och multiplex-RT-PCR påvisade inga H1N1- eller H3N2-gener (14). Viruset lämnades in till National Animal Disease Center (NADC) i februari 2007 för subtypning och sekvensering.

När septemberisolat hade subtypats och sekvenserats (beskrivet nedan) visade en sökning i journalerna att ett annat ”otypiskt” influensaisolat hade lämnats in i april 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) hade isolerats från en 12 veckor gammal gris med respiratorisk sjukdom på en annan kommersiell uppfödnings- och uppfödningsanläggning för svin. Lungelesionerna var histopatologiskt karakteristiska för svininfluensa (allvarlig, subakut inflammation i alveoler och bronker med bronkiolär epitelcellsnekros och metaplasi). Lungan var negativ för PRRSV, PCV2 och M. hyopneumonia men var positiv för influensa A-virus genom RT-PCR (specifik för NP-genen) och S. suis. Viruset lämnades in till NADC i mars 2007 för subtypning och sekvensering.

Subtypning och fylogenetisk analys.

För att identifiera och karakterisera båda influensavirusen utfördes nukleinsyrasekvensering och molekylär och fylogenetisk analys. Båda virusen sekvenserades direkt från isolat med låg passage med hjälp av MDCK-celler, och sekvenserna bekräftades efter plackrening och resekvensering. De identifierades som H2N3-virus genom nukleotidsekvens och en BLAST-sökning i Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). HA-genavsnittet i Sw/4296424 stämde bäst överens med H2-virus som isolerats från gräsänder i Nordamerika . Dess NA-segment var nära besläktat med det från ett H4N3-virus av fågelinfluensa (AIV) som isolerats från blåvingad kricka (98,3 % identitet). Med undantag för PA-genen (polymerase acidic) härstammade dess interna gener från samtida trippelassorterande svininfluensavirus som för närvarande finns i Förenta staterna. Dessa virus har interna gener från humana (PB1), aviära (PB2, PA) och svininfluensavirus (SI-tabell 4). Dess PA-segment var till 99,2 % identiskt med segmentet för H6N5 AIV som isolerats från gräsänder (SI-tabell 4). Virusen Sw/2124514 och Sw/4296424 uppvisade 99,3-99,9 % total nukleotidsekvensidentitet (SI-tabell 5). Båda isolaten har upprepade gånger plackklonats, testats på nytt och genom sekvensering bekräftats tillhöra H2N3-subtypen. H2N3-subtypen bekräftades serologiskt genom hemagglutinationshämning och neuraminidashämning. Fylogenetisk analys baserad på HA- och NA-generna visade att dessa två virus tillhör den amerikanska aviära linjen som skiljer sig från de eurasiska aviära stammarna och de H2N2-virus som isolerats från människor efter 1957 års influensapandemi (fig. 1).

Fig. 1.

Fylogenetiska träd för utvalda gener av influensavirus H2 (a) och N3 (b) baserade på nukleotidsekvenserna av ORF:erna. Det horisontella avståndet är proportionellt mot det genetiska avståndet. Träden är rotade till A/duck/Singapore/97 H5N3 (a) och A/tern/Astrakan/775/83 H3N3 (b). Siffror under noderna representerar bootstrapvärden från 200 replikat.

Molekylär analys av HA- och NA-ytproteinerna.

Influensa A-virus innehåller två ytproteiner: HA är det receptorbindande och membranfusionsglykoproteinet, och NA är ett receptorförstörande enzym. Virusets HA är en kritisk faktor för influensavirusens värdartsspecificitet (15). För att karakterisera rester inom HA som kan vara förknippade med anpassning av ett fågelvirus till däggdjursvärden jämförde vi aminosyrasekvenserna av HA från svin med aminosyrasekvenserna från de förmodade referensvirusen från fåglar. En molekylär jämförelse av HA-molekylerna från de två H2N3-isolaten från svin visade att de skiljer sig från det förmodade H2N3-referensviruset som isolerats från gräsänder genom sex gemensamma aminosyrasubstitutioner (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I och L506V) (SI-tabell 6). Substitutionen Q226L fanns i båda H2N3-isolaten från svin, medan position 228 innehöll G, vilket är identiskt med konsensussekvensen från fåglar (tabell 1) (16). Däremot innehåller mänskliga HA-molekyler av H2-subtyp 226L och 228S, medan tidiga mänskliga H2-isolat innehåller 226L och 228G (tabell 1), vilket liknar svinisolaten. Positionerna 36N, 274I, 316I och 419I är unika för de två H2N3-isolaten från svin (SI-tabell 6), medan motsvarande positioner i de isolat från människor och fåglar som visas i figur 1a är 36D, 274T, 316V och 419L. För de influensaisolat som visas i figur 1 a är position 506V bevarad hos människa, två H2N3-svinisolat och fågelisolat, med undantag för A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), vilket framgår av SI-tabell 6. Två gemensamma aminosyraförändringar i NA-aminosyrasekvensen hos de båda svinisolaten hittades vid en jämförelse med H4N3-referensviruset som isolerats från blåvingad kricka: H47Y och H253Y (SI Tabell 7). Position 47Y i båda H2N3-svinisolat är densamma som motsvarande aminosyra i eurasiska fågelisolat som visas i figur 1 b. Omvänt är positionen i nordamerikanska fågelisolat 47H. Position 253Y är unik för H2N3-isolat från svin och position 253H är bevarad i de eurasiska och nordamerikanska fågelisolat som visas i figur 1b. Intressant nog hade Sw/4296424 (H2N3), som isolerades fem månader senare än Sw/2124514 (H2N3), ytterligare två substitutioner (P162S och L321V) i HA-molekylen och tre substitutioner (V30I, I49T och A135T) i NA-molekylen jämfört med HA- och NA-molekylerna i Sw/2124514 (SI tabellerna 6 och 7). Position 30I (Sw/4296424) i NA-molekylen liknar eurasiska isolat, medan position 30V (Sw/2124514) är bevarad i nordamerikanska fågelisolat.

Visa denna tabell:

  • Se inline
  • Se popup

Tabell 1.

Genomgång av aminosyror i HA-receptorbindningsstället hos isolat av H2-influensavirus från människa, fågel och svin

Patogenicitet och överförbarhet hos H2N3-influensavirus från svin hos grisar.

För att undersöka omfattningen av anpassningen av H2N3-viruset hos svin undersökte vi dess patogenicitet hos denna värd genom att inokulera 20 fyra veckor gamla grisar med 2 × 106 50 % vävnadskulturinfektiva doser (TCID50) av Sw/4296424-viruset. Endast ett H2N3-virus valdes ut på grund av den höga identiteten mellan de två isolaten. Tolv kontrollgrisar mockinokulerades med icke-infektiös cellodlingssupernatant. Vi bedömde överförbarheten genom att sätta ihop 10 kontaktgrisar i samma ålder som de inokulerade grisarna, med början dag 3 p.i. Alla grisar som användes i studien var seronegativa dag 0 för antikroppar mot svininfluensa H1N1-, H1N2-, H2N3- och H3N2-virus med hjälp av HI-test. Fem inokulerade grisar och tre kontrollgrisar avlivades för obduktion dag 3, 5 och 7 p.i. De tio kontaktgrisarna och fem virusinokulerade grisarna testades serologiskt genom HI-analys med H2N3 dag 24 efter kontakt respektive dag 27 p.i. Inga akuta respiratoriska tecken observerades. Vid obduktion upptäcktes allvarliga makroskopiska lungskador (plommonfärgade, konsoliderade områden) hos de inokulerade grisarna, men inga hos kontrollgrisarna (tabell 2). Den histopatologiska poängen (0-3) som uttrycker omfattningen av skadorna på lungarkitekturen var >2 hos de inokulerade grisarna (tabell 2). Lungor från inokulerade grisar som avlivades dag 3, 5 eller 7 p.i. uppvisade mild till måttlig interstitiell pneumoni och akut till subakut nekrotiserande bronkiolit med lätt lymfocytisk muddring av bronkioler och kärl (fig. 2). Viruset titrerades i bronkoalveolär lavagevätska (BALF) och isolerades från nasala svabbprover. Virustitrarna i lungorna varierade mellan 104,3 och 106,5 TCID50/ml dag 3 och 5 p.i. (SI-tabell 8) och var negativa dag 7 p.i. I den H2N3-inokulerade gruppen isolerades virus från nässvabbprover hos 25 % (5 av 20) av grisarna dag 3, 67 % (10 av 15) dag 5 och 20 % (2 av 10) dag 7 p.i. I kontaktgruppen var 10 % (1 av 10) av proverna positiva dag 5 och 7 efter kontakt. Däremot var 100 % (10 av 10) av kontaktgrisarna seropositiva efter 24 dagars kontakt med vaccinerade grisar (SI-tabell 9). Vissa kontrollgrisar hade ibland ett litet fokus av mild interstitiell pneumoni (tabell 2), men de var negativa för infektion med svininfluensavirus. Alla grisar var negativa för PRRSV och M. hyopneumoniae genom PCR. Våra resultat tyder på att H2N3-viruset är patogent hos grisar och är överförbart mellan grisar.

Visa denna tabell:

  • Se inline
  • Se popup

Tabell 2.

Makroskopisk och mikroskopisk lunginflammation hos grisar som vaccinerats med H2N3-virus Sw/4296424 eller mock-inokulerade

Fig. 2.

Mikroskopiska lungsnitt från kontroll- och infekterade grisar. (a) Bronchiole i lungan hos en kontrollgris som inokulerats med icke-infektiös cellodlingssupernatant. Observera den regelbundna konturen av det pseudostratifierade kolonnära epitelet. (b) Nekrotiserande bronkiolit i lungan hos en gris 3 dagar efter inokulering med H2N3-svininfluensavirus. Luftvägarnas epitelväggar är fokuserat sönderslagna genom avskiljning av nekrotiska infekterade celler och tidig reaktiv proliferation av det återstående epitelet. Lumen innehåller avslagna epitelceller och blandade leukocyter. Ett litet antal lymfocyter ses infiltrera subepitelial och peribronkiolär bindväv.

Patogenicitet hos H2N3-svininfluensavirus hos möss.

För att testa förmågan hos H2N3 Sw/4296424-viruset att replikera hos möss, inokulerade vi 6-7 veckor gamla BALB/c-möss intranasalt med 102-106 TCID50. Möss som inokulerats med 104 TCID50 eller mer visade sjukdomstecken (t.ex. ansträngd andning, grov päls, viktförlust och letargi) (SI Tabell 10). Sjuttiofem procent av de möss som fick 106 TCID50 dog, men det förekom inga dödsfall vid lägre doser. Viralt RNA påvisades med realtids-RT-PCR (17) i lungorna hos möss efter inokulering med 106 eller 105 TCID50 (SI Tabell 10). Histopatologiskt inducerade H2N3-viruset flera eller sammanväxande foci av interstitiell pneumoni och proliferativ alveolit som kännetecknades av framträdande pneumocythypertrofi och infiltration av alveolväggarna med en blandad population av makrofager, lymfocyter och neutrofiler (SI Fig. 3). Vissa alveolärlumen innehöll fibrinproppar och lätt blandade leukocytära exudat. Sammantaget tyder dessa resultat på att H2N3 är patogent hos möss utan tidigare anpassning.

Transmissibilitet hos H2N3 svininfluensavirus hos illrar.

För att orsaka en pandemi måste ett framväxande influensa A-virus infektera människor och effektivt överföras mellan människor. För att undersöka potentialen hos det reassorterande H2N3-viruset att överföras i däggdjursystem använde vi oss av kontaktmodellen för illrar (18). Tre 18 veckor gamla illrar, som hölls i separata burar, inokulerades med 102,5 TCID50 av H2N3-viruset Sw/2124514. Efter 24 timmar placerades ett kontaktdjur i varje bur. Nässköljning togs dag 1, 4 och 7 p.i. och viruset titrerades i embryonerade ägg. Virus påvisades hos alla inokulerade illrar och kontaktillrar, men ingen av dem uppvisade uppenbara kliniska tecken (tabell 3). Dessa resultat tyder på att H2N3-influensaviruset infekterade illrar och överfördes effektivt via kontakt.

Visa denna tabell:

  • Se inline
  • Se popup

Tabell 3.

Virustitrar i nässköljningar från H2N3 (Sw/2124514)-inokulerade illrar och kontaktillrar

Serologisk undersökning av H2N3-svininfluensavirus i utbrottsgårdar.

För att ytterligare undersöka spridningen av H2N3-virus genomförde vi en begränsad serologisk undersökning av djur med anknytning till de två drabbade produktionssystemen. I den första studien, våren 2007, togs serumprover från suggor från fyra gårdar som levererade smågrisar till uppfödningsgårdarna under utbrottet i september 2006. Nittio procent (54 av 60) var seropositiva för förekomst av antikroppar mot Sw/4296424 (SI Tabell 11). Ett antal av de testade djuren var närvarande vid tidpunkten för indexfallet, och det är oklart om de smittades vid den tidpunkten eller om de smittades senare. Uppgifterna visar dock att viruset förekom på både sugg- och plantskolor och att viruset överfördes effektivt mellan djuren. Alla suggor i denna verksamhet hade antikroppstitrar >1:40 mot H1N1- och H3N2-svininfluensavirus, eftersom de tidigare hade vaccinerats med ett bivalent H1N1- och H3N2-dödat influensavaccin.

Under våren 2007 samlades också serumprover in från 30 suggor och 90 avvanda grisar som var förknippade med utbrottet i april 2006, och de testades för att påvisa förekomsten av antikroppar mot Sw/2124514 med hjälp av HI-analysen. Av de 30 suggor och 90 avvanda grisar som provtogs var 1 av 30 respektive 26 av 90 seropositiva (SI-tabell 11).

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.