Växt och etanolproduktion av S. cerevisiae NCYC 2826 på hydrolysat av vetehalm
Figur 1A visar tillväxten av S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 som odlats vid 30 °C i 36 timmar i en kultur som innehåller ett hydrolysat med en glukoskoncentration på 123 mM som framställts enligt beskrivningen i avsnittet ”Metoder”. S. cerevisiae-stammen valdes på grund av dess rapporterade höga etanoltolerans och robusthet i industriella fermentationer. Figur 1A visar att när S. cerevisiae NCYC 2826 odlades på enbart vetehalmhydrolysat var tillväxten långsam μ 0,036 h-1 och den slutliga optiska densiteten (OD) 0,8. Tillsats av jästnäringsbas (YNB) till mediet orsakade en ökning av μ till 0,135 h-1 och en slutlig OD på 1,5, medan tillsats av 2,3 mg ml-1 urea till vetehalmhydrolysatet gav en μ på 0,99 h-1 och en slutlig OD på 1,3. Tidigare studier har visat att tillskott av urea kan öka etanolproduktionen vid jästjäsning och att urea i sig är en viktig komponent i de mest minimala jästtillväxtmedierna . Våra resultat stöder dessa tidigare resultat och bekräftar behovet av urea för nästan optimal tillväxt av jäst. Efter 36 timmar mättes etanolkoncentrationen i kulturerna och avkastningen av etanol från 123 mM glukos var ungefär 90 % av den totala teoretiska avkastningen för alla kulturer. Även om etanol producerades till en jämförbar avkastning under dessa tre kulturförhållanden var tillväxten långsammare och den slutliga optiska densiteten lägre på vetehalmhydrolysat än när antingen urea eller YNB tillsattes till kulturen. Detta tyder på att även om glukos fanns tillgängligt för fermentering innehöll hydrolysatet inte tillräckligt med näringsämnen för att kulturen skulle kunna dela sig maximalt och uppnå optimal densitet.
För att undersöka orsaken till den minskade celltillväxten på vetehalmhydrolysat odlades S. cerevisiae NCYC 2826 på hydrolysat som tillverkats med 5 %, 10 %, 15 % och 20 % halmkoncentration i utgångsläget och som kompletterats med 2,3 mg ml-1 urea. Figur 1B visar att när den ursprungliga halmkoncentrationen ökade, ökade också tillväxtens fördröjningsfas till 20 timmar vid en ursprunglig halmkoncentration på 20 %. Den slutliga OD-värdet ökade också när halmkoncentrationen ökade på grund av de ökade koncentrationerna av frigjord glukos. Den ökade fördröjningsfasen är karakteristisk för att tillväxten hämmas av furanföreningar som ofta förekommer i halmhydrolysat. Analysen av furaninnehållet i hydrolysatet visade att HMF-innehållet var försumbart (data visas inte), men att koncentrationen av furfural ökade med den ursprungliga halmkoncentrationen och nådde 0,5 mg ml-1 vid 20 % ursprunglig halminnehåll (figur 2). Dessa data tyder på att tillväxten av S. cerevisiae NCYC 2826 på hydrolysat av vetehalm begränsas av koncentrationen av furfural som finns i hydrolysatet.
Koncentrationen av glukos (fyrkanter) och furfural (trianglar) som finns i hydrolysat av vetehalm som framställts enligt beskrivningen i avsnittet ’ Metoder’ med en ökande koncentration av initial halm.
Analys av SGRP-stamuppsättningens tillväxt på furfural
För att identifiera jäststammar som kan vara resistenta mot kontaminerande furfural odlades den SGRP-stamuppsättning som beskrivs i metoderna i YNB, 100 mM glukos och i närvaro av 1,5 mg ml-1 furfural. Tabell 1 visar analysen av SGRP-stammens tolerans mot 1,5 mg ml-1 furfural med hjälp av det poängsystem som beskrivs i avsnittet ”Metoder”. Det krävdes ett poängsystem i stället för genomsnittliga fördröjningstider eftersom replikat av stammar som inte växte inte hade någon mätbar fördröjningsfas men ändå behövde ingå i datasetet.
Vi hade tidigare observerat att en ökning av inokulumet i furfuralhaltiga kulturer ledde till en minskning av fördröjningsfasen, förmodligen genom att maximera mängden livskraftiga jästceller som introduceras i mediet, vilket leder till att den exponentiella fasen i tillväxten etableras snabbare (data visas inte). För dessa experiment användes därför en 5 % inokulumvolym av en odling över natten. Uppgifterna i tabell 1 visar att tillväxten på replikaplattor var extremt varierande och även stamberoende, vilket visar att en koncentration på 1,5 mg ml-1 furfural är tillräcklig för att särskilja furfuraltolerans hos stammar av S. cerevisiae och S. paradoxus. När stammarnas tillväxt testades i YNB som innehöll 100 mM glukos och antingen 2,0 eller 3,0 mg ml-1 furfural observerades mycket liten tillväxt under någon av dessa förhållanden från någon av de analyserade stammarna. Det beslutades därför att välja ut stammar med hjälp av data från 1,5 mg ml-1 och att utsätta dem för en mer detaljerad furfuralscreening. Analysen av de data som presenteras i tabell 1 visar att S. cerevisiae-stammarna överlag växte bättre än S. paradoxus-stammarna på 1,5 mg ml-1 furfural. Nästan 20 % av de testade S. paradoxus-stammarna misslyckades med att få högsta betyg i poängsystemet, medan det för S. cerevisiae var mindre än 10 %, vilket också återspeglas i det högre genomsnittliga totala betyget för S. cerevisiae på 2,5 ± 1,4 jämfört med 2,1 ± 1,4 för S. paradoxus. Inom varje stamgrupp fanns dock en betydande variation, med poäng som varierade från 1,7 till 3,7 för S. cerevisiae och från 0,3 till 3,0 för S. paradoxus. Stammar som fick mer än 2,9 poäng med en standardavvikelse på mindre än 1,5 ansågs uppvisa en betydande furfuraltolerans. Följaktligen undersöktes S. cerevisiae-stammarna NCYC 3284 (ex jord, USA), NCYC 3290 (ex bilivin, Västafrika), NCYC 3312 (ex jord, Nederländerna) och NCYC 3451 (ex vört, Irland) tillsammans med S. paradoxus NCYC 3277 (ex ekbark, Förenade kungariket) ytterligare i en mer detaljerad furfuralscreening.
Effekter av ökande koncentrationer av furfural på tillväxt och etanolproduktion
Figur 3 visar tillväxt i närvaro av varierande mängder furfural (0,1 till 4,0 mg ml-1) för S. cerevisiae-stammarna NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 och NCYC 3451 samt för S. paradoxus-stammen NCYC 3277, som i tabell 1 från SGRP-stamuppsättningen identifierats som mer motståndskraftig mot furfural. Tilläggsfil 1: I figur S1 visas motsvarande tillväxtdata plottade på en logaritmisk skala. Kontrollstammen S. cerevisiae NCYC 2826 inkluderades också för jämförande ändamål. För alla sex stammarna började tillväxtkurvorna visa en ökning av fördröjningsfasen när koncentrationen av furfural ökade, vilket tidigare setts i tillväxter som innehöll furfural. Alla testade stammar kunde växa på YNB kompletterat med 100 mM glukos och 0,1-1,5 mg ml-1 furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, vår kontrollstam, kunde endast växa på upp till 1,5 mg ml-1, vilket ledde till en 30-procentig minskning av den slutliga OD-halten jämfört med tillväxt på 0,1 mg ml-1 furfural. Tabell 2 visar att etanolproduktionen av NCYC 2826 under dessa förhållanden var avsevärt reducerad jämfört med den avkastning på cirka 90 % som observerades när den odlades på enbart YNB och glukos eller på vetehalmhydrolysat. S. cerevisiae NCYC 2826 isolerades från druvmust och det är därför osannolikt att den har utvecklat förmågan att växa och jäsa under exponering för furfural.
I sin populationsgenomikstudie har Liti et al. identifierat fem väldefinierade, geografiskt isolerade S. cerevisiae-linjer (malaysiska, nordamerikanska, Saké-, västafrikanska och ”Wine/European”) samt många olika rekombinanta (mosaik) stammar av dessa linjer. Resultaten av denna studie visar att furfuralresistens inte är en fenotypisk egenskap som är specifik för någon särskild S. cerevisiae-linje. Av de fyra furfuralresistenta SGRP S. cerevisiae-stammarna som identifierats tillhör NCYC 3284 (YPS128) den nordamerikanska stammen, NCYC 3290 (DBVPG 6044) den västafrikanska stammen, NCYC 3312 (DBVPG 1373) den ”vin- och europeiska” stammen, medan NCYC 3451 (ett derivat med en enda sportavkomma från NCYC 361) är en rekombinantstam.
S. cerevisiae NCYC 3451 uppvisade den största furfuralresistensen (figur 3F, Additional file 1: figur S1F) och kunde växa i närvaro av upp till 3,0 mg ml-1 furfural. Dessutom tycktes etanolproduktionen i denna stam inte hämmas av furfural, och det högsta etanolutbytet (95 ± 15 %; tabell 2) uppnåddes vid en (furfural)koncentration på 3,0 mg ml-1. Som redan nämnts är NCYC 3451 en rekombinant stam och har visat sig ha ett mosaikliknande genom som härstammar från minst tre olika linjer, nämligen Saké, Västafrika och ”Wine/European” (Liti et al. ). Även om den har registrerats som isolerad från vört som en ölförstörande jäst, tyder den mycket komplexa genomstrukturen hos denna stam starkt på, även om det inte är bevisat, att den är av industriellt ursprung (t.ex. en bak- eller bryggjäststam). Bland de fyra återstående SGRP-stammarna som testades kunde S. cerevisiae-stammarna NCYC 3290 och NCYC 3312 båda växa på 2,5 mg ml-1 furfural (figur 3D,C, tilläggsfil 1: figur S1D respektive S1C), medan S. cerevisiae NCYC 3284 (figur 3E, tilläggsfil 1: figur S1E) och S. paradoxus NCYC 3277 (figur 3B, tilläggsfil 1: figur S1B) endast kunde växa på 2,0 mg ml-1 furfural. Totalt sett påverkades etanolproduktionen i de fem SGRP-stammarna inte nämnvärt av närvaron av furfural. För NCYC 3312 ledde närvaron av 0,5 mg ml-1 furfural till en anmärkningsvärd ökning av etanolavkastningen, från 41 ± 8 % förväntad avkastning till 75 ± 5 % (tabell 2). Detta observerades också för ölförstörarstammen NCYC 3451, men i mindre utsträckning (endast 14 % ökning av avkastningen; tabell 2). Det har nyligen visats att små mängder furfurylalkohol, en produkt av furfuraldehydrering i jäst, faktiskt kan leda till en ökning av etanolproduktionen .
.