Hypersekretion av slem och kronisk luftvägssjukdom

Hypersekretion av slem i luftvägarna är en viktig bidragande orsak till sjuklighet och dödlighet hos många patienter med allvarliga kroniska lungsjukdomar, såsom kronisk lungobstruktiv sjukdom (KOL), astma och cystisk fibros.35 Överdriven mängd slem i luftvägarna kan begränsa luftflödet, och dess närvaro är en särskild riskfaktor för de patienter med KOL som är benägna att drabbas av bröstinfektioner. KOL är en allvarlig kronisk inflammatorisk sjukdom i luftvägarna som omfattar tre tillstånd, nämligen kronisk bronkit (långvarig hypersekretion av slem i luftvägarna), sjukdom i de små luftvägarna och emfysem.36 Den ökar världen över i prevalens och ekonomisk börda.37,38 Vid KOL har patienter med kronisk hypersekretion av slem en signifikant ökad risk för sjukhusvistelse och död jämfört med patienter utan en uttalad bronkitisk komponent.39,40 Nuvarande behandlingar för KOL är palliativa och stoppar inte sjukdomsutvecklingen,41 och det finns ingen specifik behandling för slemhinnehypersekretion.42 I avsaknad av effektiv behandling för någon aspekt av KOL:s patofysiologi är utveckling av behandlingar för slemhinnehypersekretion motiverad. Förmågan att rensa ut slem från lungorna, genom luftvägarnas cilierrörelse, beror på dess viskositet och elasticitet. Dessa egenskaper bestäms av hur stor andel mucinglykoproteiner, uttryckt i vikt, som slemmet innehåller.43 MUC5AC och MUC5B är de viktigaste mucinerna i både normala och patologiska mänskliga luftvägssekret44 . Hos patienter med KOL är nivåerna av mucinerna MUC5AC och MUC5B förhöjda i det respiratoriska slemmet, även om proportionellt sett mer MUC5B utsöndras.45 Muciner utsöndras i luftvägarna av goblettceller i epitelet och seromukösa körtlar i submucosan.43 En möjlighet att hämma slemsekretionen är att utnyttja den hämmande aktiviteten hos endopeptidaserna av clostridiernas neurotoxiner på vesikelfusion, riktad mot de mucinutsöndrande cellerna i luftvägarna med hjälp av en lämplig målinriktad ligand.

För att undersöka om ett lämpligt målinriktat klostridieendopeptidas skulle klyva SNARE-proteiner i humana respiratoriska epitelceller och därigenom hämma slemutsöndringen genererades ett fusionsprotein från en rekombinant gen som kodar för LHN-domänen av BoNT/C och EGF, benämnd EGF-LHN/C, för att rikta in sig på EGF-receptorer i de mucinutsöndrande cellerna34 . EGF valdes som prototypligand för skapandet av ett sådant fusionsprotein eftersom EGF-receptorer finns på mänskliga respiratoriska epitelceller46,47 och är uppreglerade i luftvägsepitelet hos patienter med astma och KOL48 samt rökare49 . Det rekombinanta fusionsproteinet EGF-LHN/C klyver det relevanta SNARE-proteinet syntaxin i en mänsklig mucoepidermoid metastatisk cellinje, H292-celler, in vitro på ett koncentrationsberoende sätt.34 Förbehandling av H292-celler med EGF-LHN/C hämmar den stimulerade frisättningen av mucin som svar på en kombinerad stimulans av EGF och tumörnekrosfaktor-α (TNFα) på ett koncentrationsberoende sätt, med en IC50 på cirka 0,4 nM (fig. 28-1). Detta kan jämföras mycket väl med den tidigare rapporterade hämmande effekten av EGF-LHN/C på stimulerad mucinfrisättning från en annan respiratorisk epitelcellinje, den humana alveolära typ II-cellinjen A549, som svar på samma stimulus.34 I båda celltyperna fanns det ingen påvisbar effekt av EGF-LHN/C på den basala nivån av mucinutsöndring. Hämningen av mucinutsöndringen med EGF-LHN/C beror på den riktade leveransen av dess endopeptidasaktivitet genom EGF-receptorn och är inte ett resultat av cellcytotoxicitet eller receptorantagonism eller nedreglering.34 EGF-LHN/C kan också hämma stimulerad mucinfrisättning från A549-celler som svar på en stimulerande cocktail av cytokiner, en kombination av 1 ng/mL interferon (IFN)-γ, TNFα och interleukin (IL)-1β, kallad cytomix (fig. 28-2). Effekten av EGF-LHN/C på stimulerad mucinfrisättning från respiratoriska epitelceller är således oberoende av den exakta karaktären på den stimulans som används. Histologisk undersökning visar att mucinet hålls kvar inuti de behandlade cellerna (fig. 28-3). Kontrollcellerna innehåller färgat intracellulärt mucin, medan de stimulerade cellerna uppvisar markant minskad färgning, vilket tyder på mucinutsöndring. Stimulerade celler som förbehandlats med EGF-LHN/C uppvisar kvarvarande intracellulär färgning, vilket tyder på att EGF-LHN/C hämmar sekretionen. För att bedöma cellernas reaktion på sådan intracellulär kvarhållning av mucin mättes effekten av EGF-LHN/C-förbehandling på mRNA-nivåerna av MUC5AC som en indikator på mucinsyntes. EGF-LHN/C-förbehandling är förknippad med en koncentrationsberoende hämning av EGF-TNFα-inducerat MUC5AC mRNA-uttryck, med ett IC50-värde på ∼0,1 nM (fig. 28-4). Liksom när det gäller inhiberingen av stimulerad mucinfrisättning från cellerna beror denna effekt av EGF-LHN/C på den riktade leveransen av dess endopeptidasaktivitet genom EGF-receptorn, eftersom varken en LHN/C som saknar en EGF-ligand för att rikta den mot EGF-receptorn eller en muterad form av fusionsproteinet där endopeptidasdomänen har inaktiverats genom tre restförändringar i den katalytiska regionen (EGF-TE-LHN/C) inhiberar uttrycket av MUC5AC mRNA. Denna effekt av EGF-LHN/C på mRNA-uttrycket av MUC5AC tyder på att det finns en möjlig negativ återkopplingsmekanism mellan mucinfrisättning och mucinsyntes i respiratoriska epitelceller, och även att genuttrycket nedregleras som svar på inhibering av sekretionen av ett rekombinant endopeptidas från klostridier.

Rekombinanta clostridiala endopeptidas-fusionsproteiner som kan hämma slemsekretion, vilket exemplifieras av EGF-LHN/C, har potential att utvecklas som terapeutiska proteiner för behandling av KOL, kronisk bronkit, cystisk fibros och andra kroniska luftvägstillstånd som innebär överdriven slemproduktion i luftvägarna. Den långvariga aktiviteten hos proteinet skulle innebära att produkten endast behöver inhaleras sällan, vilket gör den väl lämpad för behandling av kroniska luftvägssjukdomar av denna typ.