Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) är en genetiskt heterogen sjukdom som orsakas av germina mutationer i en av flera MMR-gener (Jiricny, 1998a,b), även om nuvarande bevis tyder på att germina mutationer i hMSH2 och hMLH1 står för majoriteten av HNPCC-fallen (Peltomäki och Vasen, 1997). HNPCC-genbärare ärver en mutation i en av de alleler som kodar för en MMR-gen, och den andra kopian muteras eller förloras som en tidig händelse i tumörutvecklingen. Denna andra händelse gör cellernas DNA-mismatch-reparation (MMR) bristfällig, vilket förmodligen leder till den snabba ackumulering av mutationer som driver tumörutvecklingen. Exakt vad som orsakar den underliggande predispositionen för kolorektalcancer hos HNPCC-personer återstår att klarlägga. Det har visats att en korrekt sammansättning av mänskliga MMR-komplex är nödvändig för en effektiv MMR för att bibehålla den genomiska integriteten (Drummond et al., 1997). Dessa uppgifter tyder på att sammansättningen, och därmed aktiviteten, av DNA-reparationskomplexen varierar mellan HNPCC-individer beroende på hur mutationen i MMR-generna är beskaffad och hur dessa gener uttrycks. Dessutom kan inblandningen av åtminstone hMLH1 och hMSH2 i andra cellulära vägar, såsom DNA-rekombination och cellcykelkontrollpunktsreglering (Jiricny, 1998a,b), som kontrollerar genomets stabilitet påverkas av mutationer i hMLH1- och hMSH2-generna. Därför kan tumörutveckling och sjukdomsförlopp variera mellan HNPCC-familjer (Jäger et al., 1997). Betydelsen av protein-proteininteraktioner i reparationskomplexen stöds av resultaten att hMSH2 existerar i komplex med antingen hMSH6 (hMutSα) eller hMSH3 (hMutSβ) och hMLH1-proteinet i komplex med antingen hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) eller hMLH3 (Drummond et al, 1995; Li och Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). Proteinet hMSH2 har också visat sig interagera med humant exonukleas 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Även om det inte är känt om hEXO1 är involverat i MMR, visar jäststammar som saknar exonukleas 1-aktivitet en ökad spontan mutationsfrekvens och en liten ökning av rekombination när heteroduplexintermediären innehåller bas-basmissmatchningar eller små slingor (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Det är känt att både exonukleas 1 (EXO1) och MMR-proteiner är involverade i homolog rekombination (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al, 1997) och att EXO1 i jäst spelar en roll vid reparation av dubbelsträngade brott och meiotisk crossing over (Tsubouchi och Ogawa, 2000).
Många studier av HNPCC har fokuserat på identifiering av mutationer i hMLH1- och hMSH2-generna. Mutationsanalys av dessa gener fastställer dock inte de molekylära och biokemiska defekter som ligger till grund för denna sjukdom. För att förbättra förståelsen av sambandet mellan förlust av hMLH1-genens funktion och HNPCC har vi karakteriserat specifika protein-proteininteraktioner i hMutLα- och hMLH1-hEXO1-komplexen med hjälp av muterade former av hMLH1 som finns hos HNPCC-patienter. Vi använde oss av jäst två-hybridsystemet samt ett glutathion S-transferas (GST)-fusionsinteraktion (pull-down) assay för att studera sådana protein-proteininteraktioner in vivo respektive in vitro.
HMLH1-proteinet existerar huvudsakligen i ett komplex med hPMS2 även känt som hMutLα-heterodimern (Li och Modrich, 1995). Bildandet av ett hMutLα-komplex är viktigt för MMR-aktivitet (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996) och därmed kan oförmågan hos HNPCC-hMLH1-proteiner att bilda ett komplex med hPMS2 resultera i ineffektiv MMR-aktivitet hos HNPCC-individer. För att undersöka den potentiella orsaken som ligger till grund för HNPCC undersökte vi om tre hMLH1-mutanter som identifierats hos danska HNPCC-patienter (figur 1) kunde interagera med hPMS2. Mutationerna omfattade en missense-mutation från treonin till metionin vid kodon 117 (T117M) i hMLH1 och två nya HNPCC-mutationer, en nonsensmutation (CAG till TAG) vid kodon 426 (Q426X) och en ramförskjutningsmutation (insättning av A vid nukleotid 1813) som resulterade i ett för tidigt stopp vid kodon 609 (1813insA) (figur 1). Pull-down-analysen med rekombinanta GST-märkta HNPCC-proteiner och in vitro transkriberad och översatt (IVTT) hPMS2 visade som förväntat att det bildades ett komplex mellan hMLH1 och hPMS2 (figur 2a, körfält 5 och 10). Dessutom upptäckte vi bildandet av ett komplex mellan HNPCC-hMLH1 (T117M) och hPMS2 (figur 2a, körfält 11). Även om vi fann att HNPCC-hMLH1 (T117M)-proteinet uttrycks i eukaryota NIH3T3-celler (data visas inte) kunde vi inte reproducera interaktionen med hPMS2 i jäst tvåhybridanalysen (figur 3a). En förklaring till denna diskrepans kan vara den tre gånger mindre komplexbildningen mellan hPMS2 och HNPCC-hMLH1 (T117M)-mutantproteinet jämfört med hPMS2- och hMLH1-proteinerna som kvantifierades med en fosfoimager (data inte visad) (figur 2a, körfält 10 och 11). Däremot kunde komplexbildningar mellan hMLH1-proteintrunkationerna HNPPCC-hMLH1 (Q426X) och HNPCC-hMLH1 (1813insA) och hPMS2 inte påvisas i någon av analyserna (figur 2a, körfält 12 och 13 och figur 3a). Ett svagt band i pull-down-reaktionen som innehöll HNPCC-hMLH1 (1813insA) och hPMS2 var synligt (figur 2a, körfält 13), men intensiteten liknade det band som erhölls i reaktionen som endast innehöll hPMS2-protein (figur 2a, körfält 3) och det är därför osannolikt att det representerar ett verkligt komplex mellan HNPCC-hMLH1 (1813insA) och hPMS2.
(a) Sekvensanpassning av MutL-familjen. hMLH1: humant MutL-homolog hMLH1, yMLH1: Saccharomyces cerevisiae MutL-homolog MLH1, MutL: Escherichia coli MutL. Konserverade rester visas med fet stil. Sekvensanpassning utfördes med ClustalW Multiple Sequence Alignment. (b) Strukturer av proteinerna hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/HEX1-C-terminal och hEXO1b-C-terminal (Y5). Tre danska familjer med diagnosen HNPCC identifierades genom det danska HNPCC-registret. Två nya HNPCC-mutationer, en nonsensmutation (CAG till TAG) vid kodon 426 (Q426X) och en ramförskjutningsmutation (insättning av A vid nukleotid 1813) som resulterar i ett för tidigt stopp vid kodon 609 (1813insA) i hMLH1, identifierades i familjer som uppfyllde Amsterdamkriterierna. Den tredje mutationen, en missense-mutation från treonin till metionin vid kodon 117 (T117M) i hMLH1, har tidigare beskrivits (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). Den hMLH1-kodande regionen klonades in i EcoRI-platsen i pcDNA3 och användes som mall för primermedierad mutagenes för att konstruera de tre olika HNPCC-mutationerna i hMLH1, T117M, Q426X och 1813insA. DNA-sekvensen för alla syntetiska mutationer och PCR-amplifierade fragment bekräftades genom DNA-sekvensering. De andra konstruktioner som används i denna studie är hPMS2 (cDNA i full längd), HEX1-N (1355 bp N-terminal region av HEX1/hEXO1a), HEX1-C (1182 bp C-terminal region av HEX1/hEXO1a) och hEXO1b-C (Y5) (1952 bp C-terminal region av hEXO1b). Alla hEXO1-konstruktioner beskrivs i detalj i Rasmussen et al., 2000)
GST-fusionsproteinassay för att studera interaktionen mellan hMLH1-proteiner och hEXO1b eller hPMS2. (a) Lane 1, märkt IVTT hPMS2-protein; lane 2,+GST-pärlor; lane 3,+BL21-lysat; lane 4,+renat GST-protein; lane 5,+renat GST-hMLH1-protein; lane 6, renat GST-hMLH1-protein och märkt IVTT-vektor; körfält 7, renat GST-HNPCC-hMLH1-protein (T117M) och märkt IVTT-vektor, körfält 8, renat GST-HNPCC-hMLH1-protein (Q426X) och märkt IVTT-vektor; körfält 9, renat GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA)-protein och märkt IVTT-vektor, körfält 10, renat GST-hMLH1-protein och märkt IVTT hPMS2-protein, körfält 11, renat GST-HNPCC-hMLH1 (T117M)-protein och märkt IVTT hPMS2-protein; spår 12, renat GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X)-protein och märkt IVTT hPMS2-protein, och spår 13, renat GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA)-protein och märkt IVTT hPMS2-protein. (b) Lane 1, IVTT hEXO1b-protein; lane 2,+GST-pärlor; lane 3,+BL21-lysat; lane 4,+renat GST-protein; lane 5,+renat GST-hMLH1-protein; lane 6, renat GST-hMLH1-protein och märkt IVTT-vektor; lane 7, renat GST-hMSH2-protein och märkt IVTT hEXO1b-protein; körfält 8, renat GST-hMLH1-protein och märkt IVTT hEXO1b-protein, körfält 9, renat GST-HNPCC-hMLH1 (T117M)-protein och märkt IVTT hEXO1b-protein; körfält 10, renat GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X)-protein och märkt IVTT hEXO1b-protein, och körfält 11, renat GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA)-protein och märkt IVTT hEXO1b-protein. Alla in vitro transkriptionstranslationsreaktioner utfördes med hjälp av TNT-kopplat retikulocytlysatsystem (Promega). Kort sagt, lysaten inkuberades med 1 μg DNA, aminosyrablandning utan cystein, 35S-Cystein och T9 RNA-polymeras i 90 minuter vid 30 °C enligt tillverkarens anvisningar. Vektorn pGEX (Pharmacia-Amersham) användes för att konstruera GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) och GST-hMSH2. Alla pGEX-konstruktioner är N-terminala GST-fusionsproteiner. DNA-sekvensering av hela kodningsregionen bekräftade alla konstruktioner. Fusionsproteinerna renades enligt beskrivningen i Guerrette et al. (1998), förutom att man använde icke-inducerade E. coli-kulturer. Pull-down-analyserna utfördes enligt beskrivningen i Guerrette et al. (1998), med undantag för inkubation av proteinerna i 2 timmar vid 30°C innan reaktionsblandningarna laddades på gelen
Interaktion av hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) och HNPCC-hMLH1 (1813insA) med hPMS2 eller hEXO1 i jäst tvåhybridsystemet. (a) β-galaktosidasaktiviteten, angiven som Miller-enheter, bestämdes enligt beskrivningen i Rasmussen et al. (2000). (b) och (c) Stammar som innehöll olika plasmider ströks på SD-LEU-TRP+X-gal-plattor. De plasmider som ingår i varje testad stam anges högst upp i varje kolumn och till vänster i varje rad. AD: aktiveringsdomän, BD: bindningsdomän. Jäst tvåhybridvektorerna pAS2-1, pBRIDGE och pACT2 (CLONTECH) användes för att konstruera GAL4-fusionsproteiner. Jäst-tvåhybridförsöken utfördes enligt tidigare beskrivning (Rasmussen et al., 2000). Kortfattat amplifierades de kodande regionerna av hMLH1 eller HNPCC-hMLH1 genom PCR och klonades in i EcoRI- och BamHI-platserna i pBRIDGE eller NcoI- och BamHI-platserna i pACT2. hPMS2 amplifierades genom PCR med pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) som mall och klonades in i NdeI- och BamHI-platserna i pAS2-1 och SmaI- och EcoRI-platserna i pACT2. Alla andra plasmider beskrivs i Rasmussen et al. (2000). Ingen av plasmiderna visade någon interaktion med tvåhybridvektorerna utan insert
Sammanhängande har det tidigare visats genom deletionsmutation att interaktionen mellan hMLH1 och hPMS2 förmedlas genom den C-terminala delen av hMLH1 (aminosyrorna 506-756) och den C-terminala delen av hPMS2 (aminosyrorna 675-850) (Figur 1b) (Guerrette et al, 1999). HNPCC-hMLH1-mutationen (T117M) har rapporterats i nio obesläktade HNPCC-familjer från olika delar av världen (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm och data som inte visas), vilket tyder på att mutationen inte är en länkad polymorfism, vilket redan visats i jäst (Shcherbakova och Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998). HNPCC-hMLH1-mutationen (T117M) är kopplad till en konserverad sekvens (figur 1) som tros vara direkt involverad i bindning och/eller hydrolys av ATP (Ban et al., 1999). Således kan missense-mutationen i HNPCC-hMLH1 (T117M) inaktivera MMR-aktiviteten genom att förändra det muterade proteinets förmåga att binda och/eller hydrolysa ATP och därmed komplexbildningen med andra MMR-proteiner. I överensstämmelse med denna hypotes visar vi att HNPCC-individer som bär på mutationerna HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) och HNPCC-hMLH1 (1813insA) har nedsatt förmåga att bilda hMutLα-heterodimerer, vilket leder till en defekt i MMR-aktiviteten när den andra hMLH1-allelen är förlorad eller inaktiverad.
I ett försök att identifiera vävnadsspecifika MMR-associerade faktorer har vi och andra nyligen identifierat ett humant exonukleas som interagerar med hMSH2 (Rasmussen et al, 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Vi visade att hMSH2 interagerar med båda formerna av hEXO1, hEXO1b och hEXO1a/HEX1, och att denna interaktion förmedlas genom deras C-terminala domäner. Däremot upptäckte vi ingen interaktion mellan hMSH6 och hEXO1 i tvåhybridsystemet (Rasmussen et al., 2000). Det är inte känt om hEXO1 spelar en roll i MMR eller om dess interaktion med hMSH2 är viktig för rekombination. Vi visar att hMLH1-proteinet, liksom hMSH2, interagerar med båda formerna av hEXO1 (hEXO1b och hEXO1a/HEX1) och att denna interaktion förmedlas genom exonukleasernas C-terminala domäner (figur 2b, körfält 5 och 8 och figur 3). Vi upptäckte ingen interaktion mellan hPMS2 och hEXO1 (figur 3a,c). Våra preliminära data tyder på att närvaron av både hMLH1- och hPMS2-proteiner inte hindrade hEXO1 från att binda till hMLH1 (data visas inte). Därför tror vi inte att hMutLα-bildningen nödvändigtvis blockerar hEXO1-bindningen till hMLH1. För att ytterligare karakterisera interaktionen mellan hMLH1 och hEXO1 konstruerade vi fluorescerande proteinfusioner av både hMLH1 och hEXO1 och introducerade dem i NIH3T3-celler (figur 4). Våra resultat visar att CFP-hMLH1 främst finns i kärnan, men vi upptäcker också en fraktion av detta protein i cytoplasman (figur 4, panel 1). Däremot upptäcker vi endast YFP-hEXO1 i kärnan (figur 4, panel 2). Vid samtransfektion med YFP-hEXO1 var dock CFP-hMLH1 helt nukleär (figur 4, panelerna 3 och 4).
Kärnärlokalisering av fusionsproteinerna CFP-hMLH1 och YFP-hEXO1b. På behandlingsdagen transfekterades murina NIH3T3-celler transient med 3,5 μg CFP-hMLH1 (panel 1) eller av YFP-hEXO1b (panel 2) eller båda konstruktionerna (panel 3 och 4). Cellerna inkuberades över natten och nästa dag undersöktes fusionsproteinernas subcellulära lokalisering med konfokal laserskanningsmikroskopi. De transfekterade cellerna visas dessutom i motsvarande Nomarski-bild. Det cDNA av hMLH1 klonades in i EcoRI- och BamHI-platserna i vektorn pECFP-C2 (CLONTECH) och det cDNA av hEXO1b klonades in i BamHI- och SalI-platserna i vektorn pEYFP-C1 (CLONTECH). Båda de fluorescerande proteinkonstruktionerna är N-terminala fusioner
Sammanfattningsvis visar dessa resultat att minst två MMR-proteiner, nämligen hMSH2 och hMLH1, interagerar med humant exonukleas 1 medan två andra MMR-proteiner, hPMS2 och hMSH6, inte är direkt involverade i interaktionen mellan hEXO1 och hXO1 när de bedöms i in vivo- tvåhybridanalysen.
För att undersöka om interaktionen mellan hMLH1 och hEXO1 kan påverkas hos HNPCC-patienter karakteriserades associeringen mellan de tre hMLH1-muterade proteinerna som beskrivs ovan och hEXO1. Positiv interaktion påvisades endast mellan HNPCC-hMLH1 (T117M) och det fullständiga hEXO1b-proteinet via in vitro pull-down-analysen (figur 2b, körfält 9). Med hjälp av in vivo tvåhybridanalysen kunde dock inte protein-proteininteraktioner mellan HNPCC-hMLH1-proteinerna och de testade exonukleas 1-konstruktionerna påvisas (figur 3). Vi kunde inte studera interaktionen mellan hEXO1 i full längd fusionerad med GAL4-aktiveringsdomänen och hMLH1-proteinerna eftersom dessa konstruktioner är icke-funktionella i jäst-två-hybridanalysen (Rasmussen et al., 2000). På samma sätt fann vi att hMLH1 och hMLH1-derivaten fusionerade till GAL4-aktiveringsdomänen resulterade i fusionsproteiner som är icke-funktionella i tvåhybridanalysen (figur 3 och data som inte visas).
Slutsatsen är att våra resultat avslöjar att tre nya HNPCC-hMLH1-mutationer som är kända för att samköras med känslighet för cancer hos HNPCC-patienter leder till en defekt i sammansättningen av hMutLα-heterodimern, vilket skulle kunna leda till minskad MMR-aktivitet. På samma sätt kan de muterade HNPCC-hMLH1-proteinerna inte heller interagera med det nyligen identifierade hEXO1-proteinet, ett protein som nu verkar interagera med hMLH1 och hMSH2, men inte med hMSH6 och hPMS2. För närvarande är de exakta biologiska vägarna och de övergripande bidragen från dessa dokumenterade interaktioner fortfarande oklara, till stor del eftersom hMLH1 har visat sig spela en roll i både MMR och rekombination. Att dissekera de molekylära defekterna i HNPCC genom att testa patogena MMR-proteiner i funktionella tester som är utformade för att kvantifiera interaktioner i proteinkomplexen bör, tillsammans med mutationsscreening, immunohistokemi och mikrosatellitanalys, bidra till att utveckla strategier för att diagnostisera och behandla bärare av HNPCC.